Clonagem de Gene Procariota e Expressão de Proteína Recombinante

Como já se sabe qual é o gene de interesse e qual a sua sequência, e como se tem acesso ao microorganismo, efetua-se a ampliação de DNA através da técnica de PCR (Polimerização em Cadeia).

O PCR é um método de ampliação de DNA que efetua vários ciclos (20-35), cada um com três etapas. A primeira etapa consiste na desnaturação da dupla cadeia, em que há separação das cadeias a uma temperatura elevada (90-100ºC), durante aproximadamente um minuto, de modo a quebrar pontes de hidrogénio. Na segunda etapa, ocorre o "annealing". Há ligação dos primers, pois a DNA polimerase não consegue iniciar a replicação. Como os primers são pequenos, é mais fácil a ligação. Ocorre a uma temperatura de aproximadamente 54ºC, durante mais ou menos 45 segundos. São usados forward e reverse primers porque existem cadeias que correm no sentido oposto. A terceira etapa consiste na extensão, e ocorre a mais ou menos 72ºC já que esta é a temperatura ótima para a Taq DNA polimerase. Sendo neste processo adicionados nucleótidos (dNTPs) do lado 3’ de cada primer. Esta etapa tem uma duração de aproximadamente 2 minutos e só termina no final do tempo, ou quando não há template ou dNTPs.

Ao longo dos ciclos é usada uma solução tampão para estabilizar o pH. No final das etapas do primeiro ciclo há duas cadeias que contém o template (gene pretendido), mas não tem o mesmo tamanho que este, e dessa forma é introduzido um primer específico para essa região, que começa num dos lados da cadeia onde está o início do gene. Apenas ao fim de três ciclos é possível ter cadeias duplas com fragmentos a ser amplificados com as dimensões certas. Como o PCR é exponencial, ao fim de vários ciclos o nº de moléculas com o gene pretendido com o comprimento não pretendido torna-se residual e praticamente constante de ciclo para ciclo. Através da electroforese verifica-se se a ampliação foi bem feita. De seguida é necessário colocar o DNA recombinante num plasmídeo. O plasmídeo tem locais de restrição para que as enzimas cortem o DNA nesse sítio. As enzimas de restrição podem cortar “blunt” ou “sticky”. A forma “blunt” consiste num corte a direito, que favorece a compatibilidade mas torna mais difícil a ligação do DNA a ser clonado ao DNA vetor. A forma “sticky” consiste na produção de extremidades coesivas, que permite que os fragmentos de DNA sejam mais facilmente ligados. Usando as “sticky-ends” é necessário digerir o DNA de forma a que as extremidades fiquem livres para o plasmídeo. No plasmídeo é necessário usar a mesma enzima de restrição de forma a que as extremidades coesivas sejam as mesmas para que o DNA se possa ligar ao plasmídeo. Após hibridação do gene e do plasmídeo com a adição de ligases de DNA, é necessário inserir o plasmídeo na bactéria. Para isso, aplica-se um choque térmico que faz com que a membrana da bactéria “abra”, inserindo-se assim o plasmídeo com DNA recombinante na bactéria. De seguida, clona-se a bactéria, plantando esta num meio de cultura. Só as bactérias com o plasmídeo pretendido crescem e sobrevivem.