Extração e Análise de DNA: Cariotipagem, Enzimas e Eletroforese

Cariotipagem: Processamento do DNA dentro da célula (em alguns casos, é necessário retirar o DNA de dentro da célula).

Extração: Depende do tipo de célula. O processo envolve romper a membrana ou parede celular, utilizando métodos físicos ou químicos.

Métodos Físicos

1. Fornecimento de energia para degradar outros componentes celulares.
2. Congelamento em nitrogênio líquido, especialmente para células de fungos ou vegetais.
3. Aumento da pressão.

Métodos Químicos

1. Uso de lisoenzimas para quebrar a parede celular (influencia a osmolaridade).
2. Uso de solução hipotônica para estourar a célula.
3. Romper a membrana para obtenção do material genético (depende do tipo de célula).

Purificação: Centrifugação para retirar componentes do DNA que não são utilizados (debris). Para uma purificação mais fina, utiliza-se resina antes da centrifugação e precipitação.

Enzimas de Restrição: Clivam o DNA em regiões específicas, reconhecendo partes ou regiões específicas do DNA.

Nomenclatura Palindrômica: (Leitura de trás para frente é igual). Exemplos: Eco RI, Taq I, Pst I, Hind III. Pontas coesivas (complementares) como em Eco RI. Corte cego como em Hae III.

A bactéria utiliza enzimas para destruir vírus bacteriófagos que a atacam. A bactéria produz enzimas de metilação para proteger seu próprio DNA contra enzimas de restrição.

Eletroforese: Visualização de fragmentos de DNA separados por tamanho ou peso. A amostra passa por um gel de agar ou agarose.

Quanto menor a molécula, mais rápido ela passa. Quanto maior a molécula, mais lento e ela fica retida na malha. O DNA possui carga negativa e migra para o polo positivo. Fatores que influenciam:

• Corrente Elétrica: Moléculas passam mais rápido com correntes maiores (ex: DDA40u).
• Tamanho dos Poros: Menos poros dificultam a passagem de moléculas maiores; muitos poros não separam as moléculas eficientemente. A quantidade de agarose varia para fazer o gel.
• Tamanho do DNA: Tamanhos diferentes migram de forma diferente na mesma concentração de gel.

Gel 0,5% (não 100-1000) porque as moléculas passam sem dificuldade. Quanto mais agarose, menos poros.

Agarose: (Não linear) Poros que não conseguem se aproximar por conta dos anéis aromáticos. Poli (linear) poros se aproximam mais e são melhores para separar fragmentos com precisão.

Corante: Brometo de etídio (cancerígeno). Brilha no DNA sob luz ultravioleta. Agente intercalante que se insere no meio da fita de DNA. É misturado ao DNA e colocado no gel para verificar o quanto correu. Visualização indireta e registro por fotos. Utiliza-se um marcador de peso (escala ou régua) aplicado com a amostra e que corre igualmente.

Análise de Fragmentos de DNA: Digestão com enzima + eletroforese de DNA = RFLP (Análise de Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrição), análise de mutações. Mutações ligadas a doenças.