Fundamentos de Microbiologia: Cultivo, Contagem e Isolamento

Semeadura e Plaqueamento de Microrganismos

Semear um microrganismo é colocá-lo em um ambiente adequado, em meio de cultura apropriado ao seu desenvolvimento e reprodução.

Considerações Importantes na Semeadura:

• Técnicas de assepsia nas manipulações;
• Esterilidade do meio e dos instrumentos de inoculação;
• Meios de cultura empregados.

Natureza do Inóculo

Inóculo refere-se a secreções, fluidos orgânicos, produtos patológicos, fragmentos de tecidos, amostras de alimentos, entre outros. Pode ser composto por:

• Bactérias provenientes de crescimento em meio de cultura sólido;
• Bactérias desenvolvidas em meio líquido.

A semeadura, plantio ou inoculação de bactérias em meios de cultura pode ser realizada de diversas maneiras.

Meios de Cultura

Os meios de cultura são classificados de acordo com sua consistência e função:

Classificação por Consistência:

• Sólido: em tubo (em coluna ou inclinado), em placa e em garrafa de Roux;
• Líquido: em balão e em tubo;
• Semissólido: em tubo.

Classificação por Função:

Pré-enriquecimento:

Dessensibilização de microrganismos injuriados.

Enriquecimento:

Crescimento de microrganismos presentes em baixo número, de crescimento lento ou fastidiosos.

Diferenciais:

Apresentam substâncias que diferenciam microrganismos semelhantes.

Seletivos:

Inibem o desenvolvimento de determinados microrganismos, permitindo o crescimento de outros.

Indicador:

Facilita a identificação de um determinado microrganismo.

Manutenção:

Conservação dos microrganismos.

Quantificação e Contagem Microbiana

A contagem microbiana é normalmente registrada como o número de células por mililitro de líquido ou grama de material.

Populações bacterianas são muito grandes, portanto, a maioria dos métodos de contagem realiza enumerações diretas ou indiretas de amostras pequenas. Posteriormente, faz-se um cálculo para determinar o tamanho total da população.

Contagem Direta de Células em Microscópio

10 mL da suspensão são fixadas e coradas em lâmina ou analisadas a fresco.

Vantagens e Limitações da Contagem Direta:

• Rápida, porém com limitações:
  • Não distingue células vivas e mortas;
  • Contagens errôneas devido a células com pequenas dimensões ou formação de agregados celulares.

Contagem Indireta de Microrganismos

O procedimento é feito indiretamente após uma série de diluições seriadas.

Vantagens e Desvantagens da Contagem Indireta:

• Vantagens: Mede o número de células viáveis.
• Desvantagens:
  • Demora 24 horas ou mais para que colônias visíveis sejam formadas;
  • Considera que cada bactéria cresce, se divide e forma uma única colônia (elas podem crescer em agregados ou cadeias);
  • Uma colônia muitas vezes resulta de um agregado bacteriano (comunidade de diferentes espécies).

Ideal: Placas devem ter entre 25 a 250 colônias (recomendação da Food and Drug Administration). Alguns microbiologistas preferem placas com 30 a 300 colônias. Para isso, o inóculo inicial é diluído várias vezes, em um processo chamado de diluição seriada.

Diluição de Amostras para Quantificação

Para contar as populações microbianas em alimentos, uma parte do alimento será misturada com nove partes de água, formando um homogeneizado.

Exemplo de Diluição Seriada:

Se adicionarmos 1 mL de amostra em 99 mL de água, cada mililitro dessa diluição terá um centésimo das bactérias que um mililitro da amostra original tinha.

Realizando uma série de diluições, podemos estimar o número de bactérias da amostra original.

Exemplo com Leite:

Se uma amostra de leite tivesse 10.000 bactérias por mililitro e se este 1 mL fosse semeado em placa, essa placa teria 10.000 colônias. Placa não contável.

Se este 1 mL fosse transferido para um tubo contendo 9 mL de água estéril, cada mililitro do fluido dentro do tubo conteria 1.000 bactérias. Placa não contável.

Se este 1 mL contendo 1.000 bactérias fosse transferido para um segundo tubo de 9 mL de água, cada mililitro nesse tubo conteria 100 bactérias. Um número facilmente contável.

Procedimento de Diluição para Amostras Sólidas

1. Antes de abrir a embalagem, limpar a área externa com etanol 75% para remoção dos contaminantes presentes.
2. A unidade analítica para a maioria dos alimentos sólidos é 25g.
3. Preparar diluições seriadas de 10^-1 a 10^-6.
4. Diluente: água salina peptonada 0,1% ou tampão fosfato pH 7,2.
5. Retirar assepticamente 25g da amostra e transferir para um triturador (liquidificador, gral e pistilo).
6. Diluição (10^-1): Transferir o material (25g da amostra) para recipiente contendo 225 mL do diluente.
7. Diluição (10^-2): Transferir assepticamente 1,0 µL da diluição 10^-1 para 9,0 mL de diluente.
8. Diluições subsequentes (10^-3 a 10^-6): São obtidas de maneira similar, transferindo-se 1,0 µL da diluição anterior para 9,0 mL de diluente.

Procedimento de Diluição para Amostras Líquidas

1. Homogeneizar o conteúdo antes da retirada da unidade analítica, invertendo-se a embalagem 25 vezes.
2. Antes de abrir a embalagem, limpar a área externa com etanol 75% para remoção dos contaminantes presentes.
3. Amostra Direta: Transferir assepticamente 1,0 mL ou 10 mL das amostras para o meio em questão.
4. Amostras Diluídas:
   1. Preparar diluições seriadas de 10^-1 a 10^-6.
   2. Diluente: água salina peptonada 0,1% ou tampão fosfato pH 7,2.
   3. Diluição 10^-1: Transferir assepticamente uma porção de 25 mL da amostra para 225 mL de diluente.
   4. Diluição (10^-2): Transferir assepticamente 1,0 µL da diluição 10^-1 para 9,0 mL de diluente.

Contagem Total de Microrganismos

Procede-se à inoculação como visto anteriormente.

• Contagem Total de Mesófilos: Incubar as placas invertidas a 35º C por 48h. Contar todas as colônias.
• Contagem Total de Psicrotróficos: Incubar as placas invertidas a 7º C por 10 dias. Contar todas as colônias.
• Contagem Total de Termófilos: Incubar as placas invertidas a 55º C por 24h. Contar todas as colônias.

Cálculo da Contagem de Colônias:

Selecionar as placas que tenham entre 25 a 250 colônias. Calcular o número de Unidades Formadoras de Colônia (UFC) por mL ou grama, multiplicando pelo inverso da diluição inoculada.

Exemplo: 100 colônias na diluição 10^-2 = 100 x 10² = 100 x 10 x 10 = 10.000 = 1,0 x 10⁴ UFC/g ou mL.

Técnica Estatística (Número Mais Provável - NMP)

Utilizada quando os microrganismos não crescem em um meio sólido ou quando é utilizado um meio líquido diferencial para identificar microrganismos.

• Quanto maior o número de bactérias em uma amostra, maior o número de diluições necessárias para "zerar" o crescimento microbiano (nenhuma bactéria presente nos tubos de diluição seriada).

Detalhes do Número Mais Provável (NMP):

• Série de 3 ou 5 diluições;
• Inoculação em triplicata;
• Análise de tubos positivos;
• Interpretação na tabela de NMP;
• O NMP obtido é estatisticamente o número mais provável;
• Fornece uma estimativa de 95% de probabilidade da população bacteriana estar em uma faixa determinada.

Contagem de Coliformes Totais (37º C) e Coliformes Fecais (45º C ou Termotolerantes)

A contagem de coliformes é baseada nas características do grupo: bastonetes Gram-negativos que produzem ácido e gás a partir de lactose.

• Coliformes Totais: Habitat intestinal e ambiental (Escherichia coli, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella).
• Coliformes Fecais: Habitat exclusivamente intestinal (Escherichia coli).

Procedimento para Contagem de Coliformes (Método NMP):

1. Teste Presuntivo:

• Presume-se que os microrganismos que crescem e produzem gás a partir da lactose sejam coliformes.
• Meio de enriquecimento: Caldo Lauryl Sulfato Triptose.
• Inocular três tubos (com tubos de Durham invertidos no seu interior) contendo 10 mL de caldo Lauryl Sulfato Triptose (dupla concentração) com 10 mL da amostra.
• Inocular três tubos (com tubos de Durham invertidos no seu interior) contendo 10 mL de caldo Lauryl Sulfato Triptose (concentração normal) com 1 mL da amostra.
• Inocular três tubos (com tubos de Durham invertidos no seu interior) contendo 10 mL de caldo Lauryl Sulfato Triptose (concentração normal) com 0,1 mL da amostra.
• Incubar a bateria com as séries de tubos a 37º C por 48h.
• Fazer a leitura, considerando positivos os tubos turvos com presença de gás no interior dos tubos de Durham.

Técnica de Isolamento Microbiano

Isolar do material uma ou mais espécies microbianas. Transplantar (repicar) uma cepa pura, visando conservá-la ou estudar suas características morfológicas, culturais e bioquímicas.

Método de Esgotamento em Estrias

Uma alça estéril é mergulhada dentro de uma cultura mista, que contém mais de um tipo de microrganismo. A cultura é então semeada na superfície de um meio nutritivo. As bactérias são depositadas na placa em forma de estrias quando a alça entra em contato com o meio.

As últimas células tendem a ficar afastadas o suficiente para crescer em colônias isoladas. O método funciona bem quando o organismo a ser isolado está presente em grande número na amostra. Quando este está presente em número pequeno, deve-se aumentar sua quantidade por enriquecimento seletivo antes do isolamento.

Repete-se a técnica para maior precisão. Essas colônias isoladas podem ser repicadas e transferidas para um tubo de ensaio com meio nutritivo para a obtenção de uma cultura pura contendo um mesmo tipo de bactéria.