Fundamentos de Microbiologia: Vírus, Bactérias, Fungos

Virologia

O que é efeito citopático?

É a denominação dada às alterações morfológicas observadas em células infectadas por vírus. Estas alterações são decorrentes da inibição da síntese de ácidos nucleicos e proteínas celulares, da fusão de células, da liberação de enzimas do lisossomo, das modificações na permeabilidade celular, das modificações nas estruturas intracelulares e aberrações cromossômicas.

Cultivo Viral e Cultivo Celular

O cultivo celular é dividido em 2 etapas:

• Cultivo Primário: É feito em tecidos de animais jovens, órgãos fetais, tratamento com tripsina a 37°C por 30 minutos, Centrifugação 3000 rpm/10 min, Incubação em estufa a 37°C e 5% CO2.
• Cultivo Secundário: Células secundárias, linhas celulares, linhagens celulares, células de linhagem, cultivo contínuo, células contínuas.

Sistemas de cultivo viral: Animais de laboratório; cultivos celulares; vírus citopatogênicos; vírus não citopatogênicos; ovo embrionado.

Estrutura que protege o ácido nucleico viral (DNA e RNA)

Qual o nome da estrutura que protege o ácido nucleico viral, seja DNA ou RNA, presente em vírions de todas as famílias?

Resposta: Capsídeo

Etapas dos Ciclos Replicativos Virais

Quais são as etapas dos ciclos replicativos viral (em ordem cronológica)? Explique brevemente cada uma delas.

Resposta:

1. Absorção (entrada): Interação com receptores.
2. Penetração: Fusão ou endocitose.
3. Expressão Gênica: Transcrição e tradução.
4. Replicação do Genoma: DNA, RNA, segmentados.
5. Morfogênese e Egresso (liberação): Brotamento ou lise.

Local de Replicação dos Vírus

Em que local das células ocorre a replicação dos vírus? Cite exemplos.

Resposta: Ocorrem no núcleo ou citoplasma da célula.

Característica Estrutural dos Vírions e Resistência

Qual a característica estrutural dos vírions que lhes oferece maior resistência no ambiente? Explique por que isso ocorre.

Resposta: A constituição por DNA ou RNA e o envoltório de proteínas, o capsídeo. Constitui a forma infectiva do vírus. Cada família de vírus apresenta vírions de formatos diferentes.

Bacteriologia

Fatores de Virulência Bacteriana

O que são fatores de virulência? Cite/explique como as estruturas/características atuam como fatores de virulência:

Resposta: São características fenotípicas que capacitam o microrganismo a causar doenças. Por exemplo, os flagelos permitem às bactérias que os possuem chegar onde as outras não podem por causa da motilidade que fornecem. Ou ainda as fímbrias que permitem a fixação e assim ser mais patogênica.

• Fímbrias: Permitem a fixação em superfícies.
• Receptores ou Integrinas: São moléculas na superfície da célula do hospedeiro reconhecidas por determinado patógeno; a maioria são glicoproteínas.
• Adesinas ou Ligantes: São moléculas na superfície do patógeno capaz de reconhecer e se ligar a um receptor específico.
• Cápsulas: Têm ação antifagocíticas.
• Flagelos: Permitem às bactérias flageladas invadir locais aquosos do corpo, dão movimento para bactérias permitindo escapar de serem fagocitadas.
• Capacidade de se multiplicar intracelular.
• Exoenzimas:
  • Necrosantes: Destruição de células e tecidos.
  • Coagulase: Se liga à protrombina (produz coágulos).
  • Quinases (fibrinolisinas): Efeito oposto à coagulase (dissolve coágulos).
  • Hialuronidase: Permitem que os patógenos se espalhem no tecido conjuntivo.
  • Colagenase: Degrada o colágeno.
  • Lecitinase: Destruição das membranas celulares do hospedeiro.
  • Hemolisinas: Lisam eritrócitos.

Endo e Exotoxinas

Endo e exotoxinas:

• Exotoxina: Liberada pela bactéria, proteína ou polipeptídeo, Gram positivas e negativas, efeito específico único, letal em pequenas quantidades, antigênicas, pode ser convertida em toxoide.
• Endotoxinas: Parte da parede celular, lipopolissacarídeo (lipídio A), Gram negativas, efeito inespecífico, letal em quantidades maiores, não antigênica, não conversível a toxoide.

Agentes Bactericidas e Bacteriostáticos, Sinergismo e Antagonismo

O que são agentes bactericidas e bacteriostáticos? O que você sabe sobre sinergismo e antagonismo entre estes agentes?

Resposta:

• Bactericida: Eliminam as bactérias.
• Bacteriostáticos: Inibem o crescimento das bactérias.
• Sinergismo: É a combinação de drogas bactericidas.
• Antagonismo: É quando se combina bactericida com bacteriostático; não há como o bacteriostático inibir o crescimento, pois a droga bactericida reduz o número de bactérias e não há como atuar.

Antibióticos: Mecanismos e Espectros de Ação

Correlacione os antibióticos com seus mecanismos e espectros de ação:

Resposta:

1. Aminoglicosídeos (A) Inibem a síntese proteica (unidade 30s); bactericidas/bacteriostáticos
2. Betalactâmicos (B) Inibem a síntese da parede celular; bactericidas
3. Quinolonas (C) Interferem na DNA girase; bactericidas
4. Sulfas (D) Inibem o metabolismo do ácido fólico; bacteriostáticos
5. Macrolídeos (E) Inibem a síntese proteica (unidade 50s); bacteriostáticos; bactericidas
6. Polimixinas (F) Estrutura da membrana citoplasmática; bactericidas

(Nota: A correlação original estava confusa. Reorganizei para uma lista clara com a correlação indicada.)

Resistência Bacteriana

Sobre resistência bacteriana, responda:

• Quais os motivos para seu aparecimento? Uso descontrolado de antibióticos.
• O que pode ser feito para evitá-la? Restringir o uso de antibióticos, receitados apenas por médicos, dosagens corretas.
• Quais tipos de resistência? Pode ser por mutações cromossomais ou pela resistência adquirida por troca de material genético.
• O que são super bugs? Microrganismos resistentes a múltiplos fármacos.

Quorum Sensing

O que é quorum sensing?

Resposta: Processo de comunicação celular mediado por densidade populacional.

Diagnóstico em Microbiologia

Métodos de Diagnóstico Viral: Diretos e Indiretos

a) Defina e diferencie métodos diretos e indiretos.

Resposta: Os métodos diretos são utilizados para a detecção da partícula viral ou de antígenos virais; como exemplo são a microscopia eletrônica, os métodos moleculares de detecção de genoma, e os métodos imunológicos (ELISA direto; Imunofluorescência direta). Os métodos indiretos são caracterizados pela detecção de anticorpos e não do antígeno/partícula viral; exemplos destes métodos são o ELISA indireto e a imunofluorescência indireta.

b) Qual a aplicabilidade de cada um, ou seja, o que significa um resultado positivo para um método direto ou para um método indireto?

Resposta:

• Métodos Indiretos: Soro-neutralização, Inibição da hemaglutinação, Imunofluorescência indireta, ELISA indireto. (Detectam a resposta do hospedeiro, geralmente anticorpos).
• Métodos Diretos: Utilizados na detecção do vírus, antígenos ou genomas virais: Microscopia eletrônica, Isolamento viral, Detecção imunológica, Hemaglutinação, ELISA direto, PCR, RT-PCR, Real-time PCR. (Detectam o próprio patógeno ou seus componentes).

c) Sorologia pareada: o que é e quando/por que razão você solicitaria?

Resposta: São todos os métodos que utilizam como amostra o "soro" do paciente (plasma sanguíneo sem fatores de coagulação). Neste soro estarão presentes os anticorpos, desta forma, todos os métodos ditos sorológicos são métodos indiretos de detecção viral.

Aplicabilidade/Razões para solicitar:

• Identificar agentes patogênicos responsáveis por mortalidade e mau desempenho produtivo.
• Determinar a distribuição da doença nos vários grupos etários.
• Determinar a prevalência e/ou incidência de doenças.
• Avaliar programas de vacinação.
• Definir o melhor momento para a aplicação de vacina.
• Monitorar o status sanitário de animais em quarentena.
• Avaliar o progresso ou sucesso de programas de controle ou erradicação.

d) Descreva brevemente o princípio (o que é detectado e de que maneira, não o protocolo) das técnicas abaixo e coloque se são métodos diretos ou indiretos de identificação das infecções víricas.

• a. Isolamento viral: Obtenção do vírus viável, permite sua caracterização e estudos posteriores. Detecção de antígenos ou ácidos nucleicos. Neutralização com soro imune específico. Método Direto. Desvantagens: caro, demorado, risco de contaminações.
• b. Microscopia eletrônica (ME): Permite a visualização de partículas víricas viáveis e também inviáveis. Aplicável virtualmente a todos os vírus. Identificação definitiva do agente. Método Direto. Desvantagens: Caro, Mão de obra especializada.
• c. Imunofluorescência direta e indireta (IFD e IFI): Técnica baseada na reação antígeno-anticorpo. Proteínas virais são detectadas por Ac conjugados com marcador fluorescente. Rápida, fácil, apresenta boa sensibilidade e especificidade. Detecta também vírus inviável.
  • Imunofluorescência direta: Diagnóstico da raiva, amostras de cérebro suspeitas. Método Direto.
  • Imunofluorescência indireta: Utilizado na detecção de anticorpos no soro do paciente por meio de antígenos fixados em uma lâmina, na qual se aplica primeiramente um anticorpo específico não fluorescente. Por fim, coloca-se um anticorpo fluorescente com especificidade marcada contra determinados antígenos do primeiro anticorpo usado para reagir com o antígeno. Método Indireto.
• d. Reação em cadeia da polimerase (PCR): É um método de amplificação (de criação de múltiplas cópias) de DNA sem o uso de um organismo vivo, por exemplo, Escherichia coli (bactéria) ou leveduras. Detecta o material genético (DNA ou RNA - via RT-PCR) do patógeno. Método Direto.
• e. Soro-neutralização (SN): Avalia a capacidade do soro do paciente (contendo anticorpos) de neutralizar a infectividade do vírus. Método Indireto.
• f. Hemaglutinação (HA) e inibição da hemaglutinação (HI): HA detecta a capacidade de alguns vírus de aglutinar hemácias. HI avalia a capacidade do soro do paciente (contendo anticorpos) de inibir essa aglutinação. HA é Direto (detecta o vírus), HI é Indireto (detecta anticorpos).
• g. Imunodifusão em gel de ágar (IDGA): Técnica baseada na precipitação de complexos antígeno-anticorpo em gel. Detecta a presença de antígenos ou anticorpos. Pode ser Direto (detectando antígeno) ou Indireto (detectando anticorpo), dependendo do formato do teste.
• h. Teste imunoenzimático (ELISA): Técnica baseada na ligação antígeno-anticorpo com detecção por enzima e substrato cromogênico. Pode ser usado para detectar antígenos (ELISA direto - Direto) ou anticorpos (ELISA indireto - Indireto).

Diagnóstico Fúngico

a) O que é e o que pode ser visualizado no exame micológico direto? Esta técnica é conclusiva para o diagnóstico?

Resposta: É a visualização do fungo ou não, pode ser positivo ou negativo. Os fungos causadores de micoses superficiais no caso da pele podem ser encontrados em animais como cães e gatos. Pode-se observar hifas de diversas formas. Esta é uma técnica conclusiva, este exame é de baixo custo e de grande segurança para o diagnóstico de doenças.

b) Cite três fatores necessários para o sucesso do cultivo ou isolamento fúngico.

Resposta:

1. Temperatura: Ótima para crescimento (ex: 40°C).
2. Condições ambientais favoráveis: pH ideal (variando entre 4 e 7).
3. Câmaras úmidas: Recipientes semi-fechados com fonte de umidade (Ex: placa de Petri com papel filtro embebido em água destilada). Ou a partir de um meio de cultura sólido ou líquido semi-sintético ou sintético (ex: tubos de ensaio ou placa de Petri contendo meio de cultura).

c) Quais os dois meios de cultivo mais utilizados para o isolamento fúngico e qual o critério de escolha entre eles?

Resposta: Um deles é Ágar Sabouraud Glicosado e outro pode ser Batata Dextrose Ágar. A escolha do meio de cultura micológico vai depender das informações clínicas ou do resultado após observado no microscópio.

d) Na “era da imunossupressão”, seja em decorrência de doenças como a AIDS ou terapias agressivas no tratamento de câncer e após transplantes, houve um aumento na incidência de infecções fúngicas e na importância da sua rápida identificação. Nesse contexto, qual a principal desvantagem na realização do isolamento/cultivo fúngico para o diagnóstico micológico?

Resposta: A principal desvantagem para o diagnóstico durante o aumento de infecções causadas por fungos e na importância da rapidez do resultado é que as técnicas que podemos utilizar detectam apenas uma espécie fúngica, levando em consideração que durante uma amostra de isolamento ou cultivo possui colônias de diversos fungos, acarretando na demora de identificação do resultado.

Conceitos Gerais em Microbiologia

Esterilização por Calor Úmido

Um exemplo de calor úmido:

Resposta: Autoclavação.

Tempo e Temperatura para Esterilização

Tempo e temperatura para forno Pasteur e autoclave:

Resposta: Forno Pasteur: 2h a 160-180°C e Autoclave: 15 min a 121°C.

Fungos Dimórficos

Os fungos dimórficos:

Resposta: Filamentosos (22 a 28°C) e leveduriforme (33 e 37°C).

Organismos (Terminologia)

Os organismos _____:

Resposta: Psicrotrófilos, mesófilos, quimio-heterotróficos.

Resistência Bacteriana (Questão Múltipla Escolha)

Sobre a resistência bacteriana, marque a alternativa incorreta:

Resposta: O surgimento das linhagens bacterianas multirresistentes está.....