Guia Completo: Isolamento de DNA, PCR e Variações

Isolamento de DNA Genómico a Partir de Tecidos Vegetais Frescos

O processo de isolamento de DNA genómico a partir de tecidos vegetais frescos envolve as seguintes etapas:

1. Ruptura das células, utilizando:

   • Brometo de Cetil Trimetilamónio (CTAB): atua como tampão.
   • 2-Mercaptoetanol: inibidor de DNAses.
   • Ácido Etilenodiaminotetracético (EDTA): agente quelante.

2. Separação de proteínas por desidratação e salting-out com solução concentrada de NaCl (em simultâneo com a homogeneização).

   • A solução é desproteinada por extração com uma solução de clorofórmio-álcool isoamílico.
     • O clorofórmio é um desnaturante proteico.
     • O álcool regula a densidade da solução final.
   • As proteínas desnaturadas formam uma camada de separação (fase orgânica/fase aquosa), onde o DNA permanece na fase aquosa sob a forma de sal sódico.
   • Após a separação, as proteínas precipitam por isopropanol, o que permite a purificação pela remoção do clorofórmio.
   • O isopropanol induz a agregação e precipitação dos ácidos nucleicos sob a forma de longas fibrilas.
   • No final: Lavagem com etanol (70%) para aumentar a pureza, pela separação de moléculas orgânicas solúveis.

Amplificação por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)

A PCR é uma reação catalisada pela DNA Polimerase, que permite amplificar seletivamente uma sequência específica de DNA.

Componentes Essenciais da Reação de PCR:

• Primers (Iniciadores): Dois oligonucleotídeos selecionados para flanquear a sequência que se deseja amplificar, sendo específicos para a região desejada.
• DNA Molde: Proveniente de várias fontes (ex: mucosa bucal, cabelos, unhas, etc.).
• 4 Nucleosídeos Trifosfatados (dNTPs): Adenina (A), Timina (T), Guanina (G), Citosina (C).
• Solução Tampão: Essencial para o funcionamento adequado da DNA polimerase.
• DNA Polimerase: Enzima termoestável (ex: Taq polimerase, isolada de organismos termofílicos), crucial porque durante a reação de PCR é exposta a temperaturas elevadas por um período considerável, o que poderia desnaturar enzimas não termoestáveis.

Fases de Cada Ciclo de PCR:

Cada ciclo compreende três fases principais:

1. Desnaturação: Separação das cadeias de DNA pelo calor (geralmente a 94-98ºC).
2. Emparelhamento (Annealing): Ocorre entre 45ºC e 72ºC, onde os primers se ligam às cadeias molde.
3. Elongação (Extensão): A 72ºC, a Taq polimerase sintetiza novas cadeias de DNA. No final de cada ciclo, obtêm-se 2 cópias do DNA desejado, resultando numa amplificação exponencial!

Variações da PCR:

• RT-PCR (PCR com Transcriptase Reversa): Utiliza a enzima transcriptase reversa para converter RNA em cDNA, permitindo o estudo de vírus e expressão génica.
• Nested PCR: Emprega uma segunda fase de primers internos aos utilizados inicialmente, aumentando a sensibilidade e especificidade do método.

Alu-TPA-25: Um Elemento Genético Móvel

O Alu-TPA-25 é um SINE (Short Interspersed Element), ou seja, um elemento genético móvel. A sua sequência é extremamente semelhante ao RNA 7S, que faz parte da partícula de reconhecimento de sinal (SRP) presente no citoplasma, facilitando o movimento de um polipéptido recém-sintetizado através da membrana do retículo endoplasmático.