Guia de Técnicas Cromatográficas e Seus Princípios

Cromatografia de Troca Iônica

Baseia-se na atração entre os íons do soluto e os sítios carregados ligados quimicamente à fase estacionária.

Trocadores de Íons

• Trocadores de Ânions: Contêm grupos positivos ligados quimicamente, atraindo os ânions do soluto.
• Trocadores de Cátions: Contêm grupos negativos ligados quimicamente, atraindo os cátions do soluto.

Resinas

• Partículas amorfas de material orgânico.
• Resinas de Poliestireno: Copolímero de estireno e divinilbenzeno (ligações cruzadas).
• O teor de divinilbenzeno influencia: rigidez, porosidade, inchamento, tempo de equilíbrio, capacidade de troca e seletividade.

Tipos de Trocadores (Força)

• Trocadores de Cátions:
  • Fortemente ácidos.
  • Fracamente ácidos: São protonados facilmente (pH ≈ 4) e perdem capacidade de troca.
• Trocadores de Ânions:
  • Fortemente básicos.
  • Fracamente básicos: São desprotonados facilmente (pH ≈ 10) e perdem capacidade de troca.

Seletividade de Troca Iônica

A constante de equilíbrio é chamada de coeficiente de seletividade, que descreve a seletividade relativa da resina para os íons. A seletividade das resinas tende a aumentar com a extensão das ligações cruzadas, pois o tamanho do poro da resina diminui com o aumento destas. Íons com raio hidratado grande não têm tanto acesso aos sítios na resina quanto íons menores. Quando a densidade de carga dos trocadores de íons é grande, eles podem se ligar irreversivelmente à resina.

Os trocadores de íons favorecem a ligação de íons com:

• Carga maior
• Raio hidratado menor
• Maior polarizabilidade

Aplicações e Eluição em Troca Iônica

As resinas de troca iônica são usadas para aplicações envolvendo moléculas pequenas que são capazes de penetrar nos poros da resina.

Os géis trocadores de íons são usados para moléculas maiores, que não conseguem penetrar nos poros das resinas.

A eluição por gradiente, com aumento da força iônica ou pela mudança de pH, é de grande valia na cromatografia de troca iônica. Por exemplo, em uma coluna capaz de reter mais o ânion A do que o ânion B, podemos separar os ânions por eluição com o ânion C, que se liga menos à coluna que A e B. Quando a concentração de C aumenta, B é eventualmente deslocado e desce pela coluna; em uma concentração maior de C, o ânion A também é eluído.

Aplicações Comuns

A troca iônica é muito usada na:

• Purificação de água.
• Conversão de um sal em outro.
• Separação de íons enantioméricos.
• Estabilização de medicamentos (para ajudar na desintegração de comprimidos).
• Mascaramento de paladares.

Cromatografia com Supressão Iônica

Na cromatografia aniônica com supressão iônica, uma mistura de ânions é separada por troca iônica e detectada por condutividade elétrica. Sua principal característica é a remoção do eletrólito eluente indesejado antes da medida de condutividade.

A cromatografia catiônica com supressão iônica é conduzida de forma semelhante, mas o supressor substitui o cátion eluente (por exemplo, H+) por H2O, ou o ânion eluente (por exemplo, Cl-) por OH-.

A coluna de separação separa os analitos, e o supressor substitui o eluente iônico por uma espécie não iônica ou de baixa condutividade.

Cromatografia sem Supressão Iônica

Se a capacidade de troca iônica da coluna de separação for suficientemente baixa e se for usado um eluente diluído, a supressão iônica é desnecessária. Além disso, os ânions provenientes de ácidos fracos (borato, silicato, sulfeto, cianeto) não podem ser determinados com supressão iônica, pois esses ânions são convertidos em espécies com condutividade muito baixa.

Detectores em Cromatografia Iônica

• Detectores de Condutividade: Respondem a todos os íons.
• Detectores Espectrofotométricos: Respondem a compostos que absorvem no UV/VIS ou emitem fótons (fluorescência).
• Detectores Amperométricos: Um potencial é aplicado entre o eletrodo de referência e o de trabalho.
• Espectrometria de Massa: Responde a todos os íons.

Cromatografia de Par Iônico

Na cromatografia de par iônico, usa-se uma coluna de fase reversa de HPLC (CLAE). Adiciona-se um surfactante à fase móvel para fornecer cargas à coluna para interação.

• Surfactante aniônico: Usado para misturas de cátions. Quando os cátions passam pela coluna, associam-se aos ânions do surfactante na fase estacionária devido à atração eletrostática.
• Surfactante catiônico: Usado para misturas de ânions.

Essa cromatografia é mais complexa, pois o equilíbrio entre o surfactante e a fase estacionária é lento. A separação é mais sensível às variações de temperatura e de pH, e a concentração do surfactante afeta a separação. O mecanismo é uma mistura das interações de fase reversa e troca iônica.

Cromatografia por Exclusão Molecular (Filtração em Gel ou Permeação em Gel)

As moléculas são separadas de acordo com seu tamanho. As moléculas pequenas penetram nos poros da fase estacionária, mas as maiores não. Com isso, as moléculas maiores eluem primeiro.

Parâmetros Importantes

• V₀ (Volume Morto): Volume da fase móvel fora das partículas de gel.
• V_m (Volume Total da Fase Móvel): Volume total acessível à fase móvel (intersticial + intrapartícula).
• K_med (Coeficiente de Distribuição): Fração do volume dos poros acessível à molécula (aproximadamente V_m - V₀ representa o volume dentro das partículas).
• V_r (Volume de Retenção): Volume necessário para eluir o soluto.
• V_t (Volume Total da Coluna)

Comportamento de Eluição

• Molécula grande (não penetra no gel): V_r ≈ V₀, K_med ≈ 0
• Molécula pequena (penetra livremente no gel): V_r ≈ V_m, K_med ≈ 1
• Moléculas de tamanho intermediário (penetram parcialmente): 0 < K_med < 1
• Nota: K_med pode ser maior que 1 se houver adsorção na fase estacionária.

Fases Estacionárias

• Quanto menor for o tamanho da partícula do gel, maior será a resolução obtida e menor será a vazão permitida da coluna.
• Partículas com tamanhos de poros diferentes podem ser misturadas de modo a permitir uma faixa de separação de tamanho molecular mais ampla.

Determinação da Massa Molecular

• A massa molecular é estimada comparando o volume de eluição (V_r) com volumes de eluição de padrões conhecidos.
• Atenção: Moléculas com a mesma massa molecular, mas formas diferentes, exibem características de eluição diferentes.
• Limite de Exclusão: Define a massa molecular da espécie além da qual não ocorre retenção significativa nos poros (eluem com V₀).
• Limite de Permeação: É a massa molecular abaixo da qual as moléculas do soluto podem penetrar completamente nos poros (eluem com V_m).

Cromatografia de Afinidade

É usada para isolar um único composto (ou uma classe específica) a partir de uma mistura complexa. A técnica se fundamenta na ligação específica e reversível entre um composto (analito) e um ligante imobilizado na fase estacionária.

O soluto aderido é removido (eluído) mudando-se uma condição do eluente, como pH, força iônica ou pela adição de um competidor, para enfraquecer a ligação específica.

Utilizada principalmente em bioquímica e para isolar isômeros ópticos.

Exemplos de Interação

• Enzima ↔ Substrato/Inibidor
• Anticorpo ↔ Antígeno
• Receptor ↔ Hormônio/Ligante