H2: Marcadores Moleculares, Transgênicos e Biossegurança

Marcadores Moleculares, Transgênicos e Biossegurança

Conceitos Fundamentais em Genética Molecular

Marcadores Moleculares

• Definição: Segmentos de DNA ou proteínas que indicam a presença de uma característica genética específica em um organismo. Podem ser usados para rastrear a herança de genes em diferentes gerações.
• Importância: São ferramentas essenciais na biologia molecular, genética e biotecnologia, permitindo a identificação de indivíduos com características desejáveis ou a distinção entre diferentes espécies ou variedades.

Marcadores Genéticos

Características Desejáveis:

• Polimorfismo: Capacidade de existir em várias formas. Marcadores altamente polimórficos são preferidos porque permitem distinguir entre diferentes indivíduos ou linhagens.
• Herdabilidade: Devem ser transmitidos de maneira estável de uma geração para outra.
• Capacidade de Detectar Múltiplos Loci: Permitem o estudo de várias partes do genoma simultaneamente.

Aplicações dos Marcadores Moleculares

• Diversidade Genética:
  • Uso: Avaliação das variações dentro e entre populações de plantas ou animais. Isso pode ajudar em programas de conservação ou no desenvolvimento de novas variedades.
  • Ferramentas Comuns: Análise de microssatélites, AFLP, e SNPs (Polimorfismo de Nucleotídeo Único).
• Mapeamento Genético de Ligação:
  • Objetivo: Criar mapas que mostram a localização de genes ou marcadores ao longo dos cromossomos.
  • Aplicação: Útil para identificar genes associados a doenças ou características econômicas importantes.
• Seleção Assistida por Marcadores (SAM):
  • Definição: Processo de usar marcadores moleculares para selecionar indivíduos com genes desejáveis, acelerando o processo de melhoramento genético.
  • Vantagem: A SAM pode reduzir significativamente o tempo necessário para desenvolver novas variedades de plantas ou raças de animais.

Tipos de Marcadores Moleculares

• Isoenzimas:
  • Definição: Diferentes formas de uma enzima que são codificadas por diferentes genes.
  • Uso: Frequentemente usadas para estudos de diversidade genética e para resolver questões taxonômicas.
• RFLP (Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição):
  • Funcionamento: Envolve o uso de enzimas de restrição para cortar o DNA em fragmentos, que são então separados por eletroforese e hibridados com sondas de DNA específicas.
  • Aplicações: Mapas genéticos e identificação de polimorfismos ligados a genes de interesse.
• RAPD (Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso):
  • Vantagens: Rápido e barato, não requer conhecimento prévio da sequência de DNA.
  • Limitações: Pode ser menos reprodutível e sensível a condições experimentais.
• Microssatélites:
  • Definição: Sequências curtas de DNA repetitivas que variam em número de repetições entre diferentes indivíduos.
  • Importância: Altamente polimórficos e úteis para estudos de paternidade, mapeamento genético e análise de diversidade.

Técnicas de Análise

• PCR (Reação em Cadeia da Polimerase):
  • Definição: Técnica para amplificação de uma sequência específica de DNA, permitindo a criação de milhões de cópias de uma sequência alvo a partir de uma pequena quantidade de DNA.
  • Passos Principais:
    1. Desnaturação: Separação das duas fitas de DNA.
    2. Anelamento: Ligação dos primers às sequências alvo no DNA.
    3. Extensão: A DNA polimerase sintetiza novas fitas de DNA a partir dos primers.
• Eletroforese:
  • Definição: Técnica para separar moléculas de DNA, RNA ou proteínas com base no tamanho, movendo-as através de um gel sob um campo elétrico.
  • Tipos de Gel:
    • Agarose: Usado para fragmentos maiores de DNA.
    • Poliacrilamida: Usado para separar proteínas ou pequenos fragmentos de DNA.

Melhoramento Genético

• Métodos Tradicionais:
  • Seleção Fenotípica: Baseia-se na observação das características físicas de um organismo para seleção.
  • Desafios: Demorado e menos preciso em comparação com técnicas modernas, especialmente para características com herança complexa.
• Métodos Modernos:
  • SAM: Permite a seleção baseada diretamente na presença de marcadores moleculares ligados a características desejáveis, mesmo sem a expressão fenotípica completa.
  • Vantagens: Acelera o processo de melhoramento, especialmente em espécies com ciclos de vida longos.

Genética de Populações

• Teorema de Hardy-Weinberg:
  • Princípio: Em uma população ideal (grande, sem mutação, migração, seleção ou deriva genética), as frequências alélicas e genotípicas permanecem constantes ao longo do tempo.
  • Importância: Serve como modelo nulo para entender como diferentes fatores (como seleção e deriva genética) afetam a variação genética em populações reais.
• Estrutura Genética Populacional:
  • Análise: Avalia como a variação genética é distribuída entre e dentro de populações. Isso é crucial para entender a evolução e planejar estratégias de conservação.

Ferramentas e Tecnologias

• Termociclador:
  • Função: Controla as temperaturas necessárias para cada ciclo de PCR, automatizando o processo de amplificação do DNA.
• Gel de Agarose:
  • Uso: Meio através do qual fragmentos de DNA são separados durante a eletroforese. A concentração de agarose no gel determina a resolução da separação dos fragmentos.

Transformação Genética e Organismos Geneticamente Modificados (OGMs)

Conceitos Fundamentais

• Definição de Transformação Genética:
  • Transformação genética refere-se ao processo pelo qual uma célula ou organismo incorpora DNA de outra fonte em seu próprio material genético. Isso pode ocorrer naturalmente (como em bactérias) ou ser induzido artificialmente em laboratório.
  • É um mecanismo crucial na biotecnologia para o desenvolvimento de Organismos Geneticamente Modificados (OGMs), que podem ter características novas ou melhoradas.
• História e Descoberta:
  • O conceito de transformação genética foi primeiro descrito por Frederick Griffith em 1928 através de seus experimentos com bactérias. Ele demonstrou que características hereditárias podem ser transferidas de uma célula para outra por meio de material genético.
  • A identificação do DNA como o "fator transformante" foi feita por Oswald Avery, Colin MacLeod e Maclyn McCarty em 1944.

Técnicas de Transformação Genética

Métodos de Introdução de DNA:

• Eletroporação: Técnica que utiliza pulsos elétricos para criar poros temporários nas membranas celulares, permitindo que o DNA exógeno entre na célula.
• Biobalística: Também conhecida como “canhão de genes,” esta técnica dispara partículas revestidas com DNA em células para introduzir o material genético.
• Vetores Virais: Utiliza vírus modificados para inserir DNA em células hospedeiras, aproveitando a capacidade natural dos vírus de invadir células.

Uso de Vetores:

• Plasmídeos: Pequenas moléculas de DNA circular usadas como vetores em bactérias e outras células. Eles podem ser manipulados para carregar genes específicos e depois introduzidos em células-alvo.
• Vírus Recombinantes: Vírus que foram geneticamente modificados para carregar genes de interesse. Eles são usados principalmente em terapia gênica e biotecnologia vegetal.

Seleção de Células Transformadas:

Após a transformação, é essencial selecionar células que realmente incorporaram o DNA exógeno. Isso é feito usando marcadores de seleção, como genes de resistência a antibióticos, que permitem que apenas as células transformadas cresçam em ambientes contendo o antibiótico.

Aplicações da Transformação Genética

• Melhoramento Genético de Plantas:
  • A transformação genética é usada para criar plantas que possuem características desejáveis, como resistência a pragas, herbicidas ou condições ambientais adversas.
  • Exemplo: O desenvolvimento da soja transgênica resistente ao herbicida glifosato, que permite o controle de ervas daninhas sem danificar a cultura.
• Produção de Organismos Geneticamente Modificados (OGMs):
  • OGMs são organismos cujo material genético foi alterado usando técnicas de engenharia genética. Eles são amplamente utilizados na agricultura (para aumentar a produtividade e resistência a pragas) e na medicina (como na produção de insulina humana recombinante).

Questões Éticas e Legais

• Impacto Ambiental e Segurança Alimentar:
  • Estudo dos debates sobre os possíveis efeitos negativos dos OGMs no meio ambiente, como a polinização cruzada com plantas não-transgênicas e a resistência de pragas a pesticidas.
  • A segurança alimentar dos OGMs também é uma questão de grande preocupação, com debates sobre alergênicos potenciais e a rotulagem de alimentos transgênicos.
• Regulamentação e Normas:
  • Familiarização com as regulamentações que governam a criação, uso e liberação de OGMs no meio ambiente. Diferentes países têm diferentes normas e regulamentos, o que pode afetar o comércio internacional de produtos transgênicos.

Casos de Estudo e Exemplos Práticos

Transformação Genética em Plantas:

• Milho Bt: Um exemplo de OGM desenvolvido para ser resistente a insetos, através da introdução de um gene da bactéria Bacillus thuringiensis, que produz uma toxina letal para certas pragas.
• Arroz Dourado: Um exemplo de biofortificação, onde o arroz foi geneticamente modificado para produzir beta-caroteno, um precursor da vitamina A, com o objetivo de combater a deficiência de vitamina A em regiões subdesenvolvidas.

Transformação Genética em Animais:

• Peixe transgênico (Salmão AquAdvantage): Primeiro animal transgênico aprovado para consumo humano. Este salmão foi modificado para crescer mais rápido que os salmões selvagens.
• Animais modelos (camundongos transgênicos): Usados em pesquisa biomédica para estudar doenças humanas, onde genes específicos são alterados para observar seus efeitos.

Técnicas Avançadas e Inovações

• CRISPR-Cas9 e Edição de Genes:
  • CRISPR-Cas9 é uma técnica revolucionária de edição de genes que permite alterar o DNA de maneira precisa, eficiente e relativamente simples.
  • Compreensão de como a tecnologia funciona, incluindo o uso de RNA guias para direcionar a enzima Cas9 a sequências específicas de DNA.
• Aplicações do CRISPR: Desde a correção de mutações causadoras de doenças até a criação de culturas agrícolas mais resistentes, a CRISPR tem amplas aplicações na biotecnologia.

Regulamentação e Biossegurança de OGMs

Obtenção de Transgênicos

• Todas as etapas são regulamentadas por leis.
• Nova Lei de Biossegurança: Lei 11.105 de 24 de março de 2005.
• Riscos:
  • Desde a fase laboratorial até o destinatário final do produto, passando por danos ao ecossistema.
  • Fluxo gênico, segurança alimentar, a criação de novas pragas e plantas daninhas, a produção de substâncias tóxicas a organismos não-alvo, perturbações de comunidades bióticas, efeitos adversos ao ecossistema.

Histórico da Biossegurança

• A preocupação com o uso dos OGMs surgiu logo no início da sua utilização – década de 1970:
  • Transferência do gene de resistência múltipla a antibióticos para a bactéria E. coli.
  • Criação de uma molécula híbrida de DNA contendo o genoma completo do vírus Simia 40 e um segmento de DNA responsável pelo metabolismo da galactose em E. coli.
  • Comunidade científica em alerta às possibilidades ilimitadas que as novas ferramentas estavam trazendo e seus imprevisíveis impactos à saúde humana e ambiental.
• 1974: Conferência de Asilomar sobre as Moléculas de DNA Recombinante:
  • Discussão sobre os critérios de segurança – barreiras biológicas e físicas – para experimentos com OGMs.
  • Critérios éticos para regular os experimentos.
  • Recomendações para o controle de descartes de materiais e padronização de metodologias.
• Regras de Biossegurança: Assegurar o avanço dos processos tecnológicos e a proteção da saúde humana, animal e ambiental.
• 1992: Convenção de Diversidade Biológica (CDB – ECO 92):
  • Todos os países signatários tomaram medidas para preservar a diversidade das espécies nativas e cultivadas, considerando o valor intrínseco dessas espécies como material para desenvolver novo produto de interesse econômico.
  • Soberania de cada país sobre seus recursos genéticos: NINGUÉM PODE REMOVER ESPÉCIES VEGETAIS, ANIMAIS OU MICRORGANISMOS DE UM PAÍS SEM O PRÉVIO CONSENTIMENTO DESSE PAÍS.
• Protocolo de Cartagena:
  • Estabelecimento de bases para a normatização internacional do desenvolvimento dos OGMs, em especial, ao movimento desses organismos vivos entre países.
  • Regulamenta a transferência, a manipulação e o uso de OGMs que podem ter efeito na biodiversidade e saúde humana, fazendo referência ao Princípio da Precaução – guia para a transferência de OGMs em situações consideradas potenciais de risco de redução ou perda de biodiversidade.
  • Ratificado por 50 países em 2002 – tem sido o alicerce para o desenvolvimento de bases legais e administrativas de biossegurança em diversos países.

Biossegurança de OGMs

Estuda os impactos dessas tecnologias por meio de leis, procedimentos e diretivas discutidas mundialmente, porém aplicadas de modo específico em cada país.

Segurança Alimentar

• Histórico:
  • Necessidade de estoques estratégicos de alimentos – 1ª Guerra Mundial.
  • Noção de direito humano à alimentação – 2ª Guerra Mundial.
  • 1970: foco em qualidade – segurança dos aditivos alimentares.
  • 1980: resíduos de agrotóxicos e irradiação nos alimentos.
• Atualmente: Foco em Alimentos Transgênicos.

Segurança Alimentar de OGMs: Considerações da FAO

1. Consequências indiretas de alterações no nível de expressão de genes existentes pela introdução do novo gene ou modificações genéticas causadas por eles.
2. Consequências diretas da presença, nos alimentos, da proteína codificada pelo gene introduzido. Ex: Efeitos antinutricionais, tóxicos ou alergênicos.
3. Consequências indiretas dos efeitos de qualquer produto ou nível alterado de produto já existente no metabolismo do organismo, levando à presença de novos compostos ou níveis alterados de compostos já existentes.
4. Consequências das mutações causadas no processo de introdução genética no organismo, tais como a interrupção de sequências codantes ou controle ou ativação de genes latentes, levando à presença de novos componentes ou níveis alterados de compostos existentes.
5. Consequências da transferência do gene para a flora gastrointestinal pela ingestão do alimento geneticamente modificado ou alimentos derivados dele.
6. Potencial efeito adverso na saúde associado ao microrganismo geneticamente modificado pelo alimento.

Biossegurança Ambiental

Impacto das tecnologias Bt (resistência a insetos) e HT (tolerância a herbicidas).

Considerações a respeito do impacto ambiental das lavouras de soja, milho e algodão transgênicos:

1. Risco da variedade cultivada ou silvestre “transformada” tornar-se uma espécie daninha invasora (Risco de desenvolvimento de Super plantas):
   • Década de 1970: glifosato foi classificado tendo baixa probabilidade de induzir resistência.
   • O aparecimento de plantas daninhas resistentes a herbicidas ocorre não por modificação genética, mas pelo manejo da cultura e do herbicida utilizado pelo produtor.
   • Cultivo de plantas HT em rotação com cultivares convencionais ou resistentes a diferentes herbicidas evita o desenvolvimento de plantas resistentes.
2. Desenvolvimento de resistência pelo uso maciço da tecnologia:
   • Alta adesão mundial dos produtores ao plantio de soja resistente ao glifosato representou a maior adoção de uma tecnologia na história da agricultura.
   • Glifosato: Herbicida de largo espectro e baixo impacto ambiental – boa aceitação.
   • Plantas Bt – resistentes a insetos: potencial indução da resistência na população de insetos selvagens em decorrência da pressão de seleção pelo uso intensivo dessas plantas.
3. Possibilidade de escape gênico (transferência vertical ou horizontal) / Resistência por fluxo gênico:
   • A introgressão é o movimento de um gene ou genes de uma planta doadora para outra sexualmente compatível de genótipos diferentes por polinização seguida de cruzamentos entre híbridos dentro da população até a estabilidade do gene na população.
   • Para ocorrer fluxo gênico é necessário que ambas as espécies/variedades se encontrem na mesma fase de receptividade do pólen e floração.
   • Pode haver fluxo gênico entre variedades transgênicas e silvestres. Ex: Canola.
4. Efeito adverso sobre espécies não-alvo e benéficas:
   • Há bastante discussão do efeito de plantas transgênicas sobre as espécies não-alvo – plantas Bt.
   • Espécies não-alvo: não são propósito direto de uso de um pesticida em particular.
   • A resistência a insetos, introduzida nas plantas Bt, é a expressão da proteína Cry do Bt.
   • Alvo: lagartas da ordem lepidóptera – Milho Bt e algodão Bt.
   • Preocupação: efeito sobre outras espécies de lepidópteros não-alvo, como a borboleta monarca.
5. Impactos no sistema de produção vegetal:
   • O plantio das culturas OGMs atuais aumenta ou diminui o uso de pesticidas?
   • Ex: Redução cumulativa no ingrediente ativo do pesticida de 172.500 t entre 1996 e 2004 – equivalente a um decréscimo de 14% no impacto ambiental associado ao uso de pesticidas nas lavouras.
   • Avaliação desses números conforme o tipo de OGM e do local onde ele é introduzido.

Quociente de Impacto Ambiental (EIQ)

• EIQ: Uso de pesticidas na área.
• Integração de vários impactos ambientais de cada ingrediente ativo do pesticida.
• Fórmula: EIQ = quantidade de ingrediente ativo X hectare de cultivo de OGM.