Introdução à Virologia: Estrutura, Classificação e Cultivo
Classificado em Biologia
Escrito em em 
português com um tamanho de 23,21 KB.
Introdução à Virologia
Introdução
- “Vírus” (latim – “veneno”)
- Agentes infecciosos pequenos (20 a 300 nm)
- Agentes filtráveis
- Ácido nucléico envoltos por uma capa protéica
- Alguns têm envelope
- Contêm somente um tipo de ácido nucléico
- RNA ou DNA (linear, circular, fita simples ou dupla)
- Não podem se replicar extracelular
- Total dependência de células vivas (replicação)
- Afinidade por tipos celulares específicos
Relação de tamanho
Microscópio eletrônico: até 600.000 x
18 nm x 600.000 = 10,8 mm = 1,08 cm
Relação de tamanho
Vírus é um parasita intracelular
obrigatório, pequeno (nm), infeccioso e
que necessita de uma célula hospedeira
para a produção de progênie.
O que é um vírus?
- São parasitas intracelulares obrigatórios.
- O genoma é composto por um tipo de ácido nucleico DNA ou RNA, nunca ambos.
- O genoma viral direciona a síntese dos componentes virais pela célula hospedeira.
- A progênie viral é produzida pela reunião dos componentes sintetizados na célula hospedeira.
- A progênie é liberada da célula hospedeira e iniciam uma nova infecção.
Propriedades dos vírus
Famílias - características genéticas, físico-químicas e biológicas
- tipo e estrutura do ácido nucleico (DNA ou RNA)
- estrutura do vírion (tamanho, forma, envoltório)
- estratégias de replicação
Classificação dos vírus
Ordem -virales Mononegavirales
Família -viridae Paramyxoviridae
Subfamília - virinae Paramyxovirinae
Gênero -vírus Respirovirus
Espécie vírus individual vírus da parainfluenza humana (hPIV)
Tipo número hPIV-1 e hPIV-5
Taxonomia dos vírus
Família Subfamília Gênero Espécie-tipo
Adenoviridae Aviadenovirus Adenovírus aviário A
Asfaviridae Asfivirus Vírus da peste suína africana
Herpesviridae Alphaherpesvirinae
Vírus Doença de Marek
Vírus Laringotraqueíte infecciosa
Vírus da Doença de Aujezsky
Herpesvírus galináceo 2
Herpesvírus galináceo 1
Poxvirinae Chordopoxvirinae Avipoxvirus
Suipoxvirus
Poxvírus aviário
Poxvírus suíno
Famílias contendo vírus-DNA de fita dupla de vertebrados
Circoviridae Circovirus
Gyrovirus
Circovírus suíno
Vírus da Anemia Infecciosa das Galinhas
Famílias contendo vírus-DNA de fita simples de vertebrados
Taxonomia dos vírus
Retroviridae Alpharetrovirus Vírus da Leucose aviária
Retrovírus de vertebrados
Famílias contendo RNA de fita dupla de vertebrado
Birnaviridae Avibirnavirus Vírus da Doença de Gumboro
Reoviridae Orthoreovirus Vírus da Reovirose
Taxonomia dos vírus
Famílias contendo vírus-RNA de fita simples e sentido negativo de vertebrados
Família Gênero Espécie-tipo
Orthomyxoviridae Influenzavirus A Influenza aviária
Influenza suína
Paramyxoviridae Vírus da Doença de Newcastle
Famílias contendo vírus-RNA de fita dupla e sentido positivo de vertebrados
Família Gênero Espécie-tipo
Coronaviridae Coronavirinae Vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas
Vírion - refere-se a partícula infecciosa
Sorotipo ou sorogrupo - reação sorológica
Amostra viral - vírus isolado de um caso clínico
Cepa - vírus padrão, usado como referência
Variante - variação de um vírus
Mutante - vírus contendo alguma alteração no genoma
Terminologia em virologia
Composição dos vírus
- Ácido nucleico
- RNA ou DNA
- Proteínas
- Formam o capsídeo, tegumento e proteínas do envelope
- Lipídios
- originários das membranas celulares
- Carboidratos
- mucopolissacarídeos e oligossacarídeos
14
VIRUS
Genoma
DNA/RNA
Envelope
Capsídeo
DNA GENOMAS VIRAIS RNA
Cadeia Simples
Cadeia Dupla
Circular
+ ou -
Segmentado
Cadeia dupla segmentado
Estrutura viral
Terminologia usada para descrever a estrutura viral
Protômero - subunidade estrutural dos capsômeros;
Capsômero – unidade estrutural do capsídeo, formado pelos protômeros;
Capsídeo – reunião de capsômeros, capa proteíca ao redor do genoma;
Nucleocapsídeo ou core – capsídeo + genoma;
Genoma – material genético do vírus (DNA ou RNA);
Envelope – camada lipídica que envolve o capsídeo dos vírus envelopados;
Estrutura viral
Vírus não envelopado - Adenovírus Vírus envelopado - Herpesvírus
Proteínas virais Capsídeo
Membrana da célula hospedeira
LIPID
BILAYER
Proteínas celulares
+ +
+
+ +
+ +
+
+ -
+ +
+
+ +
+
+
+
+ +
+
- -
- - -
- -
- -
- - -
- - +
+
+
+
24
Proteína
viral
Membrana celular
DNA
ICOSAHEDRAL COMPLEX
ENV. NON-ENV. ENV.
DS SS DS DS
HERPESVIRIDAE
HEPADNAVIRIDAE
PARVOVIRIDAE PAPOVAVIRIDAE
ADENOVIRIDAE
POXVIRIDAE
ICOSAHEDRAL HELICAL
ENV. NON-ENV. ENV.
SS SS DS SS
TOGAVIRIDAE
FLAVIVIRIDAE
(RETROVIRIDAE)
PICORNAVIRIDAE
CALICIVIRIDAE
REOVIRIDAE RHABDOVIRIDAE
PARAMYXOVIRIDAE
BUNYAVIRIDAE
ARENAVIRIDAE
ORTHOMYXOVIRIDAE
CORONAVIRIDAE
(RETROVIRIDAE)
RNA
Vírus DNA
Vírus DNA
- Poxviridae
- Pleomórficos
- Envelopados
- 220-450nm
- Simetria complexa
Vírus DNA
- Adenoviridae
- Não envelopados
- 80-110 nm de diâmetro
- Contorno hexagonal
- Simetria icosaédrica
- Fibras projetando-se dos vértices
Vírus DNA
- Herpesviridae
- Envelopados
- 120-200 nm diâmetro
- Simetria icosaédrica
- Morfologia pleomórfica
Papilomaviridae
- Não envelopados
- 52-55 nm diâmetro
- Simetria icosaédrica
Vírus DNA
Parvoviridae
- Não envelopados
- 18-26 nm diâmetro
- Simetria icosaédrica
Vírus DNA
Vírus RNA
Vírus RNA
- Picornaviridae
- Não envelopados
- 22-30 nm de diâmetro
- Forma esférica
- Simetria icosaédrica
Vírus RNA
- Coronaviridae
- Envelopados
- 80-220 nm de diâmetro
- Simetria helicoidal
- Formato esférico em forma de coroa
Vírus RNA
- Rhabdoviridae
- Envelopados
- 70 nm X 170nm
- Simetria helicoidal
- Forma de projétil
Vírus RNA
- Orthomyxoviridae
- 80-120 nm de diâmetro
- Simetria helicoidal
- Envelope com spikes
- Morfologia pleomórfica
Filoviridae
- Envelopados
- Pleomórficos
- 80 nm X 1400 nm
- Simetria helicoidal
Vírus RNA
Flaviviridae
- Envelopado
- 50-70 nm de diâmetro
- Simetria icosaédrica
- Esférico, pleomórfica
Vírus RNA
Paramyxoviridae
- Pleomórficos
- Envelopados
- 150-200 nm
- Simetria helicoidal
- Morfologia: pleomórfica
Vírus RNA
Retroviridae
- Envelopados
- 80-100 nm
- Simetria icosaédrica
Vírus RNA
Replicação viral
1 - Adsorção,
2 - Penetração,
3 - Desnudamento,
4 – Transcrição dos genes virais;
5 – Tradução dos RNAm virais;
6 – Replicação do genoma,
7 - Morfogênese,
8 – Egresso ou liberação.
Membrana celular - “receptor”
Entrada do vírus: fusão com a membrana celular
Entrada do vírus: via endocitose
Entrada do vírus: transporte do DNA viral ao núcleo celular
- mecanismo de síntese proteíca e replicação é determinado pela estrutura do genoma
dsDNA - utiliza maquinária nuclear da células hospedeira para replicar o genoma e sintetizar mRNA (exceção aos poxvírus).
ssDNA - é convertido em dsDNA pela maquinária celular e replica desta forma.
+RNA - semelhante ao mRNA, é traduzido diretamente pelo ribossomas celulares.
-RNA - polimerase presente no vírion, responsável pela síntese de mRNA e + RNA.
dsRNA - mecanismo semelhante aos -RNA.
Retroviruses - o RNA é convertido em DNA pela transcriptase reversa presente no vírion, o cDNA é integrado ao genoma celular.
Síntese de proteínas e replicação do genoma
Parental (+) Strand
Protein Synthesis
Minus Strand
Synthesis (Stage 1)
Plus Strand
Synthesis (Stage 2)
Progeny (+) Strands
5
5
5
5
3
3
3
3
(+)
(+)
(+)
(-) (-)
(-)
(+)
(+)
Membrana lipídica
Proteína celular de membrana
citoplasma
Glicoproteínas virais
Nucleocapsídeo
viral
Matrix viral
Egresso
Nucleocapsídeo
Egresso viral
Partícula viral infecciosa
Reunião e egresso dos vírus envelopados
nucleocapsídeo
citoplasma
Membrana celular
Proteína viral Proteína celular
CICLO
VIRAL
LIGAÇÃO
PENETRAÇÃO
REUNIÃO
(MATURAÇÃO)
Transcrição
REPLICAÇÃO
LIBERAÇÃO
DESNUDAMENTO
Tradução
MULTIPLICATION
0 h
8 h
5.5 h
24 h
Progressão do efeito citopatogênico - poliovírus
Exposição e transmissão
1 – Transmissão vertical
- transplacentária
- perinatal
2 – Transmissão horizontal
- contato direto
- contado indireto
- vetor biológico
- vetor mecânico
Mecanismo de produção da doença
1 – Variação antigênica
2 – Infecção subclínica
3 – Infecção persistente
4 – Transmissão vertical
5 – Reservatórios
6 – Resistência viral
Mecanismos de sobrevivência dos vírus
Técnicas empregadas para detecção
- Técnicas indiretas
- detecção da resposta imune (Ac): ELISA ou soroneutralização
- Técnicas diretas
- Microscopia eletrônica (ME)
- cultivo celular: (vírus citopático e vírus não citopático)
- presença de corpúsculo de inclusão intranuclear ou intracitoplasmático
- imunofluorescência e imunoperoxidase
- detecção de material genético
- ex: SDS-PAGE para RNA e PCR
Cultivo viral
Objetivos:
isolamento “crescimento” viral;
diagnóstico viral;
produção de vacinas;
Detecção viral
Sistemas de cultivos viral:
animais de laboratório;
cultivos celulares;
vírus citopatogênicos
vírus não citopagênicos
ovo embrionado;
Cultivo viral
Cultivo celular
- formação de uma monocamada ou tapete
Cultivo celular
- Células não infectadas
Cultura primária fibroblastos humanos
Cultura diplóide fibroblastos camundongos
Linhagem Transformada (HeLa)
Efeito Citopático dos Vírus: Qualquer alteração morfológica, provocada pela infecção viral na célula, visível ao microscópio óptico. Ex.
Infecção pelo Herpes Simples 1 em célula Vero
Cultivo celular
- Células infectadas por vírus citopáticos
- Visualização do efeito citopático
- Tipos/formas de efeito citopático
- Arredondamento celular;
- Desprendimento do tapete;
- Enrrugamento do tapete;
- Vacuolização celular;
- Lise celular;
- Citomegalia;
- Sincício;
- Corpúsculo de inclusão.
HSV CMV RSV
Primária de rim
coelho
Fibroblasto
embrionário
Humano
Hep-2
Ovos Embrionados
Cowpox-Formação de “pock” na membrana cório alantóica de ovos embrionados de galinha inoculados aos 11 dias e incubados 3 dias a 37,5°C.
Corpúsculo de inclusão
- Corpúsculo de inclusão
- in vitro e/ou in vivo
- intranuclear ou intracitoplasmático
Corpúsculos de Negri (raiva)
Imunofluorescência
Microscopia eletrônica
Microscopia eletrônica
Universidade Federal do Pampa
Curso de Medicina Veterinária
Aula prática Microbiologia Veterinária
CULTIVO CELULAR
Profa. Carolina Kist Traesel
Uruguaiana, 28 de novembro de 2014
CULTIVO CELULAR
- Cultivo primário
- Cultivo secundário (linhagem celular)
Cultivo Primário
Tecidos
de
animais
jovens
Órgãos
fetais
Cultivo Primário
Tratar
com
tripsina
37oC/30min
Tripsina
Cultivo Primário
Cultivo Primário
Centrifugação 3000rpm/10min
Cultivo Primário
Cultivo Primário
Tapete/monocamada
Cultivo Primário
Incubação em estufa à 37oC e 5% CO2
Tapete
confluente
Tripsinizar
Cultivo Primário
CULTIVO PRIMÁRIO
- Vírus
- Resiste poucas passagens
- Exigente/delicado
Cultivo Secundário
- Células secundárias, linhas celulares, linhagens celulares, células de linhagem, cultivo contínuo, células contínuas.
Sinonímia:
Linhagens celulares
Cultivo primário
senescente
Algumas células
sobrevivem
Linhagens celulares
Retomam
multiplicação
Tornam-se
imortais
Células
primárias
senescentes
Tapete
confluente
Tripsinizar
Tripsinizar
Linhagens Celulares
Linhagens Celulares
--‐
Mantidas
em
laboratório
por
diversas
passagens
--‐
Congeladas
em
nitrogênio
líquido
1 2 3 4
5 6 7 8
Linhagens Celulares
Bovinos
MDBK
CRIB
BL--‐3
Bt
Suínos
PK-15
PK-1
SK-6
ST
Ovinos
FLK
Caninos
MDCK
Felinos
CRFK
Equinos
ED
EO
Coelhos
RK--‐13
Primatas
VERO
CV--‐1
Marc--‐145
COS
Humanos
HeLa
Universidade Federal do Pampa
Curso de Medicina Veterinária
Aula prática Microbiologia Veterinária
CULTIVO CELULAR
Profa. Carolina Kist Traesel
Uruguaiana, 05 de dezembro de 2014
Cul?vo
viral
• Amostra
viral
• Amostra suspeita
• Amostra clínica
• Estoque viral
• Tabela
de
qual
tecido
para
qual
doença
Doença
Animal
vivo
Post
mortem
Respiratória
e
ocular
Suabe
nasal
e
conjun?val,
sangue
Tecidos
afetados,
LN
Pele
e
mucosas
Suabes,
raspados,
sangue
Tecidos,
LN
Gastroenterites
Fezes,
sangue
Tecidos,
LN,
conteúdo
intes?nal
Sistêmica
Sangue,
fezes,
suabe
nasal,
urogenital
Tecidos
de
vários
sistemas
SNC
Sangue,
fezes,
suabe
nasal,
urogenital
Tecidos,
LN
Aborto
Sangue
da
mãe,
muco
genital
Placenta,
FETO
Inoculação
viral
• Metodologia
• Adsorção
(inóculo);
• Reposição
de
meio
de
cul?vo;
• Incubação
24
–
72
horas
(replicação
viral);
errado correto
Cul2vo
viral
–
célula
não
infectada
Cul?vo
viral
• Células
infectadas
por
vírus
citopá?cos
– Visualização
do
efeito
citopá3co
• Tipos/formas
de
efeito
citopá3co
– Arredondamento
celular;
– Desprendimento
do
tapete;
– Enrrugamento
do
tapete;
– Vacuolização
celular;
– Lise
celular;
– Citomegalia;
– Sincício;
– Corpúsculo
de
inclusão;
Cul2vo
viral
–
herpesvírus
bovino
2po
1
Cul2vo
viral
–
herpesvírus
bovino
2po
2
Cul2vo
viral
–
vírus
da
diarréia
viral
bovina
Corpúsculo
de
inclusão
• Corpúsculo
de
inclusão
– in
vitro
e/ou
in
vivo
– intranuclear
ou
intracitoplasmá3co
Cul?vo
viral
• Células
infectadas
por
vírus
nao--‐citopá?cos
– Sem
“lesão
celular”
– Visualização?
detecção
de
proteínas
virais