Metodologias para Determinação de Organismos Viáveis em Água

Que metodologias podem ser usadas para determinar o nº de organismos viáveis numa amostra de água? Indique as vantagens e desvantagens de cada uma.

Um organismo viável é aquele que tem capacidade para se dividir e originar novos organismos. Existem duas formas de determinar o nº de organismos viáveis na amostra: espalhamento em placa e incorporação em agar. No espalhamento em placa, fazem-se sucessivas diluições na amostra inicial, uma vez que esta se encontra muito concentrada em relação ao meio de cultura. Cada diluição é espalhada em duas placas de Petri contendo meio de cultura com 0,1 ml de amostra. Após o plaqueamento e incubação, por tempo e temperatura adequados, os organismos crescem isoladamente, dando origem a colónias que serão contadas na diluição apropriada, e portanto chamadas unidades formadoras de colónia (UFC). Uma desvantagem deste método é que, nos tubos muito diluídos, não há células suficientes, e nos tubos concentrados, há excesso de células, não sendo possível fazer uma contagem adequada nessas placas.

O método da incorporação em agar tem como meio de cultura o agar fundido, o que permite o crescimento de organismos no interior deste e não só ao longo da superfície. Fazem-se sucessivas diluições da amostra inicial, e em seguida adiciona-se 1 ml numa placa de Petri estéril, adicionando-se em seguida o agar líquido. A homogeneização do inóculo é feita com movimentos suaves, e é necessário garantir que o meio não solidifique antes da homogeneização nem fique muito quente de modo a não matar os organismos. De seguida, procede-se à incubação. A escolha do meio é crítica, dado que os meios de cultura e as condições de incubação devem ser adequados aos organismos. Este método é vantajoso porque é mais rápido. Tem desvantagens, como o fato de os organismos aeróbios poderem ter dificuldade em se desenvolver, e também o fato de o choque térmico provocado pela adição de meio de cultura poder inibir os organismos.

Imagine que lhe dão um microorganismo recentemente identificado e lhe pedem para determinar a velocidade máxima de crescimento e Ks num meio de cultura contendo glucose como fonte de carbono. Descreva detalhadamente as experiências que iria realizar, bem como os cálculos que efetuaria para determinar esses dois valores.

No estado exponencial, as células dividem-se por divisão binária e, por isso, o número de células aumenta exponencialmente. A taxa de crescimento é a variação do nº de células por unidade de tempo, sendo proporcional à diversidade populacional (N) nesse instante.

Assim: (dN/dt) = µN; Ln(N/N0) = µ(t-t0), sendo N0 o nº de células e µ a taxa específica de crescimento. Na fase exponencial, através da fórmula anterior, obtém-se um valor de µ para uma dada concentração de substrato. Repete-se este processo várias vezes. O crescimento microbiano obedece a uma dependência entre a taxa de crescimento e a concentração de substrato: µ = µmáx(S/Ks + S), em que S é a concentração de substrato e Ks é a constante de Monod.

Fazendo uma linearização: (1/µ) = (1/µmáx) + ((Ks/µmáx)*(1/S))
y = mx + b Com os vários valores de µ obtidos anteriormente (cada um corresponde a uma dada concentração de substrato):

Traça-se a reta e fica a saber-se o valor de b, que corresponde a (1/µmáx).

Assim, obtém-se o valor de µmáx. Temos também o declive da reta, que corresponde a Ks/µmáx. Como µmáx já é conhecido, e o declive também, calcula-se Ks.