Métodos Analíticos: Cromatografia, Imunoensaios e Monitorização

1. Caracterize os Métodos Cromatográficos:

a) CCD - Cromatografia em Camada Delgada

Consiste na separação dos componentes de uma mistura através da migração diferencial desses componentes quando arrastados pela fase móvel (solvente) sobre uma camada delgada de adsorvente. É uma técnica de adsorção líquido-sólido.

b) CG - Cromatografia a Gás

• Está baseada na partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel (gasosa) e a fase estacionária (líquida ou sólida).
• Os gases utilizados como fase móvel devem ter alta pureza e ser inertes em relação à fase estacionária.
• Hidrogênio, nitrogênio e hélio são os mais usados.

c) HPLC - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

• Técnica que utiliza como fase móvel um líquido e equipamentos sofisticados para separar os componentes de uma amostra pela interação com a fase estacionária e com a fase móvel.
• Utilizada para compostos de alto peso molecular e pouco voláteis, bem como materiais termicamente instáveis.

2. Vantagens e Desvantagens dos Métodos Cromatográficos

a) CCD

Vantagens:

• Método rápido, eficiente, de baixo custo.

Desvantagens:

• Baixa precisão na quantificação (relativamente em comparação com HPLC e CG).
• Falta de automação.

b) CG

Vantagens:

• Alto poder de resolução, tornando possível, algumas vezes, a análise de várias substâncias na mesma amostra.
• Grande sensibilidade, permitindo o uso de uma pequena quantidade de amostra para análise.
• Rapidez da análise, aproximadamente 18 minutos.

Desvantagens:

• Exige calibração.
• Possui custo elevado pelo consumo de gases como hélio, ar sintético e hidrogênio.

c) HPLC

Vantagens:

• A fase estacionária é usada várias vezes.
• Versatilidade na solubilidade da amostra na fase móvel.
• Boa para análise qualitativa.
• Bons resultados quantitativos: desvios inferiores a 5%.
• Boa detectabilidade.
• Automação.

Desvantagens:

• Alto custo do equipamento.
• Alto custo de manutenção do equipamento.
• Não há um detector universal com boa detectabilidade e baixo custo.
• Exige experiência do operador.

3. Colunas Comumente Utilizadas em CG e HPLC

a) CG:

• Coluna capilar de sílica fundida.

b) HPLC:

Utilizam-se colunas metálicas e fase móvel pressurizada obtida com auxílio de bombas de alta pressão, para permitir a vazão mais rápida da fase móvel.

• Preparativa (d.i. > 10 mm).
• Convencional (d.i. > 2-5 mm).
• Microbore (d.i. 1 ou 2 mm).
• Capilar (d.i. 0,075 - 0,5 mm).

4. O que é o FID?

5. O que é o RIA?

Radioimunoensaios. O termo radioimunoensaio (RIA) é mais empregado em ensaios com antígenos marcados.

6. Características Gerais do RIA

• Em 1959, Berson e Yalow desenvolveram o primeiro RIA para quantificação de insulina.
• Primeira técnica imunológica padronizada capaz de detectar e quantificar substâncias da ordem de nano a picogramas.
• Determina qualquer tipo de molécula biológica, desde que haja um receptor específico e que a molécula biológica possa ser marcada.
• Apresenta alta sensibilidade, que é conferida pela detecção radioativa.
• O RIA também apresenta elevada especificidade.
• Graças à sua especificidade, os ensaios podem acontecer diretamente no líquido biológico.
• Por causa da sua sensibilidade, o volume de amostra pode ser menor.

7. Vantagens e Desvantagens do RIA em Relação a Outros Métodos

Vantagens:

• Método muito sensível, específico e de alta afinidade.
• Baixo custo.
• Requer pouca amostra.
• Rápido.

Desvantagens:

• Instabilidade dos radioisótopos.
• Risco operacional.
• Necessidade de medidas especiais.
• Elevado custo de biossegurança e problemas com o descarte de material.

8. Tipos de RIA e Descrição de um Exemplo

• De competição com anticorpo marcado.
• De competição com antígeno marcado.
• Sanduíche ou captura de antígeno.
• Para detecção de IgE:
  • Paper Radioimmunosorbent Test (PRIST).
  • Radioallergosorbent Test (RAST).

Exemplo: RIA de Competição com Anticorpo Marcado

• Inicialmente, antígenos são fixados na fase sólida.
• A seguir, acrescenta-se a amostra do paciente.
• Os anticorpos específicos e marcados com o radioisótopo são acrescentados.
• Se a amostra for positiva, haverá a formação do complexo Ag/Ac com o antígeno do soro.
• Quanto maior a quantidade de antígeno na amostra, maior será a ligação destes aos anticorpos, formando imunocomplexos, que serão retirados por lavagem e, assim, reduzindo a leitura da radioatividade.

9. Diferenças entre os Métodos ELISA e RIA

RIA:

Reação de competição por um receptor comum entre uma substância a ser determinada e a mesma substância marcada radioisotopicamente.

ELISA:

Imobilização de um dos reagentes (Ag ou Ac) na fase sólida, enquanto o outro reagente (Ag ou Ac) está ligado a uma enzima.

10. Tipos de ELISA em Fase Sólida e Caracterização

• Competitivo
• Não competitivo-indireto
• Sanduíche ou de captura

Indireto:

1ª Etapa: Sensibilização da Placa

• Ligação do Ag ou Ac à placa, através de interações hidrofóbicas.
• Lavagem.

2ª Etapa: Bloqueio

• Bloqueio com solução com alta concentração de proteína inerte (leite desnatado, albumina bovina - BSA). Serve para evitar ligações inespecíficas.
• Lavagem.

3ª Etapa: Adição da Amostra

• Soro.
• Lavagem.

4ª Etapa: Adição do Conjugado

• Anticorpo marcado com enzima.
• Lavagem.

5ª Etapa: Adição do Substrato

• Cromógeno - Formação de uma cor.

6ª Etapa: Adição da Solução STOP

11. Vantagens do ELISA sobre o RIA

• Cuidados com interferentes.
• Reações cruzadas.

12. O que é a Monitorização Terapêutica?

• Monitorar ou medir os níveis sanguíneos dos fármacos ou drogas com um objetivo terapêutico.
• Otimizar as doses para cada paciente (compensar a variabilidade individual).
• Boa correlação entre a concentração sanguínea do fármaco no sítio de ação com a resposta farmacológica. Observação: Medir o fármaco no local de ação é impossível.
• Forte correlação entre a concentração sanguínea e seus efeitos farmacológicos (maioria das substâncias).

13. Quando Realizar a Monitorização Terapêutica?

• Durante terapias de longa duração.
• Mudanças no estado de saúde do paciente.
• Existe toxicidade relacionada à dose.
• Resposta terapêutica inadequada.
• Suspeita de falta de aderência.
• Suspeita de sobredose.
• Mudanças na formulação do medicamento.
• Suspeita de interação entre fármacos.

14. Principais Fármacos que Necessitam de Monitorização Terapêutica

• Anticonvulsivantes (Carbamazepina, fenitoína, fenobarbital, topiramato, etc.)
• Antimicrobianos (Vancomicina, amicacina, gentamicina, etc.)
• Antidepressivos (Amitriptilina, nortriptilina, etc.)
• Imunossupressores (Sirolimus, tacrolimus, ciclosporina, ácido micofenólico)
• Antirretrovirais (Inibidores de protease)
• Outros: benzodiazepínicos, antipsicóticos, antifúngicos, antiarrítmicos, etc.

15. Exemplo de Medicamento para Monitorização Terapêutica

Vancomicina

Critério de Exclusão:

• Quando não há necessidade de monitorar nível sérico.
• Adultos com menos de 60 anos e peso normal.
• Tempo de tratamento igual ou inferior a sete dias.

Critérios de Inclusão:

• Quando é necessário o monitoramento de nível sérico.
• Tratamento com Vancomicina superior a sete dias.
• Insuficiência renal (Clcr < 40 mL/min).
• Alteração da função renal devido a aumento da creatinina sérica em 0,5 mg/dL ou 50% do basal.