Microbiologia Essencial: Conceitos, Crescimento e Técnicas

1. Domínios da Vida e Suas Características Principais

• Bactéria: Células procarióticas com espécies patogênicas e não patogênicas. Sua parede é constituída de peptidoglicanos.
• Archaea: Células procarióticas não patogênicas. São microrganismos extremófilos, pois vivem em ambientes extremos e de maior diversidade.
• Eukarya: Células eucarióticas. Podem ser uni ou multicelulares e possuem organelas.

2. Fases do Crescimento Bacteriano e Métodos de Contagem

Quais são as fases de crescimento bacteriano?

As bactérias possuem quatro fases de crescimento:

• Fase de Lag (ou Adaptação): A taxa de crescimento é igual a zero. As bactérias se preparam para a fissão binária, adaptando-se ao ambiente e reconhecendo os nutrientes disponíveis para garantir sua sobrevivência.
• Fase Logarítmica (ou Exponencial): A taxa de crescimento é máxima e constante. As bactérias crescem exponencialmente até atingir o tamanho máximo, utilizando os nutrientes presentes no meio.
• Fase Estacionária: O crescimento é igual a zero devido à escassez de nutrientes e ao acúmulo de produtos metabólicos tóxicos. A taxa de divisão celular é igual à taxa de morte celular.
• Fase de Morte: As bactérias não possuem nutrientes suficientes para suprir o crescimento e começam a morrer em grande número.

Qual a melhor fase para medir o crescimento bacteriano?

A melhor fase para se medir o crescimento é a exponencial, pois há o rendimento máximo da célula e a taxa de crescimento é constante.

Como a célula bacteriana se multiplica?

A célula bacteriana se multiplica principalmente por fissão binária, um processo que ocorre de forma mais intensa na fase exponencial.

3. Isolamento e Diagnóstico de Microrganismos em Amostras Clínicas

Um material coletado na cavidade oral de um paciente, com quadro clínico de abscesso, foi levado a um laboratório de análises para cultura, identificação do microrganismo causador do quadro clínico e antibiograma.

A) Quais os procedimentos que devem ser feitos para o isolamento do microrganismo causador do quadro clínico, antes que a identificação do mesmo possa ser efetuada?

O procedimento a ser feito é a técnica de esgotamento. Uma alça de inoculação estéril deve ser mergulhada na cultura mista e, posteriormente, utilizada para fazer estriamentos em uma placa de Petri em três divisões, de forma que as estrias não se toquem. Essa técnica faz com que a quantidade de material contida na alça seja progressivamente menor. Dessa maneira, restam apenas células do microrganismo isolado (colônias). Essas colônias podem ser removidas por uma alça de inoculação também estéril e transferidas para um tubo de ensaio contendo meio nutriente, originando culturas puras contendo somente um tipo bacteriano.

B) Por que não podemos utilizar o material coletado diretamente para a cultura e diagnóstico laboratorial?

Não podemos utilizar o material coletado diretamente porque ele não seria necessariamente uma colônia pura, podendo conter mais de um tipo de microrganismo. Sendo assim, o diagnóstico não seria preciso, pois a presença de múltiplos microrganismos dificultaria a identificação do agente etiológico e a realização de um antibiograma eficaz.

4. Mecanismos de Transferência Genética Bacteriana

• Transformação: A transferência de genes ocorre de forma direta, onde o DNA livre no meio é incorporado por uma célula receptora, que poderá integrá-lo em seu genoma e apresentar alterações genéticas.
• Transdução: O mecanismo se faz de forma indireta, via bacteriófagos. A transferência de DNA da célula doadora para a receptora é mediada por um vetor viral (o bacteriófago).
• Conjugação: A transferência se dá através do plasmídeo, que é passado de uma bactéria a outra por meio do píli sexual (ou fímbria sexual).

5. Análise de Testes Bioquímicos para Identificação Bacteriana

Um pesquisador, ao tentar identificar uma bactéria através da realização de testes bioquímicos, obteve os seguintes resultados: fermentação da glicose (-); teste VM (+); presença de enzima amilase (+); teste de SIM: motilidade (+) e indol (-) e presença de enzima catalase (+). Analisando os resultados obtidos, existe algum resultado não esperado? Diga qual ou quais, justificando sua resposta.

Sim, existe um resultado não esperado: o teste VM positivo (+).

Justificativa: O teste VM (Vermelho de Metila) identifica se a bactéria é capaz de produzir ácidos estáveis como produtos finais da fermentação. No entanto, como o teste de fermentação da glicose deu negativo, isso indica que a bactéria não fermenta a glicose e, portanto, não produz ácidos como produto da fermentação. Consequentemente, não é possível que o teste VM dê positivo, pois não haveria ácidos para serem detectados.

Os outros resultados (teste do amido positivo, indicando produção de amilase, e teste da catalase positivo, indicando presença de catalase) são consistentes e esperados dentro de um perfil bioquímico.

6. Alvos de Ação dos Antimicrobianos: Parede Celular

Um dos principais alvos dos antimicrobianos é a parede celular bacteriana. Os antimicrobianos que atuam nesse alvo impedem a síntese completa de peptidoglicana, enfraquecendo a parede celular e levando à lise da bactéria. Os beta-lactâmicos, por exemplo, possuem como mecanismo de ação um efeito bactericida. Eles inibem a ação das transpeptidases (enzimas responsáveis pela formação das ligações cruzadas na peptidoglicana) e promovem a atividade de autolisinas, enzimas que degradam a peptidoglicana, resultando na ruptura da parede celular.

7. Coloração de Gram: Etapas Essenciais e Diferenciação

Qual é a etapa fundamental da coloração de Gram?

A etapa fundamental da coloração de Gram é a etapa 3: a descoloração com álcool/acetona (solução orgânica). Nesse momento, o etanol é aplicado, e todas as células Gram-positivas retêm o complexo cristal violeta-iodo, permanecendo roxas, enquanto as Gram-negativas perdem o complexo e ficam incolores.

O que separa as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas?

A separação entre bactérias Gram-positivas e Gram-negativas ocorre precisamente na etapa de descoloração. As Gram-positivas, com sua espessa camada de peptidoglicana, retêm o corante primário (cristal violeta) mesmo após a lavagem com álcool. As Gram-negativas, com sua fina camada de peptidoglicana e membrana externa, perdem o corante. A diferenciação final é visível após a quarta etapa (contracoração), onde as Gram-positivas continuam roxas e as Gram-negativas coram-se de rosa/vermelho com a safranina.

8. Métodos de Esterilização: Aplicações e Condições

Como se esteriliza:

1. Soro com bactéria: FILTRAÇÃO
2. Luvas: RADIAÇÃO (Gama ou UV)
3. Alguma coisa de plástico: RADIAÇÃO (Gama ou Óxido de Etileno)
4. Tesoura de metal: CALOR (Autoclave ou Calor Seco/Estufa)
5. Tubos contendo soro fisiológico: FILTRAÇÃO
6. Tubos contendo uma solução de antibiótico: FILTRAÇÃO

Especifique os métodos e as condições necessárias para a esterilização dos diferentes tubos:

Para o soro fisiológico e a solução de antibiótico, a filtração é o método preferencial. O soro fisiológico, sendo uma solução aquosa, poderia ter sua concentração alterada se submetido à autoclave devido à evaporação da água. Além disso, a solução de antibiótico é frequentemente termolábil (sensível ao calor), o que significa que altas temperaturas (como as da autoclave) poderiam degradar o antibiótico, tornando-o ineficaz. A filtração estéril remove microrganismos por exclusão física, sem a necessidade de calor, preservando a integridade das substâncias termolábeis e a concentração das soluções.

9. Mecanismos de Ação de Beta-Lactâmicos e Aminoglicosídeos

Os beta-lactâmicos impedem a síntese completa de peptidoglicana, enfraquecendo a parede celular. Eles possuem como mecanismo de ação um efeito bactericida, inibindo a ação das transpeptidases (enzimas PBP - Penicillin-Binding Proteins) e promovendo a atividade de autolisinas, enzimas que degradam a peptidoglicana, levando à lise celular.

Os aminoglicosídeos se ligam à proteína S12 da subunidade 30S do ribossomo bacteriano. Essa ligação interfere na leitura correta do RNA mensageiro (mRNA), causando erros na incorporação de aminoácidos e resultando na produção de proteínas não funcionais. Além disso, eles impedem o movimento do ribossomo ao longo do mRNA, interrompendo a síntese proteica e levando à morte celular (efeito bactericida).

10. Esterilização de Meios de Cultura Termolábeis

Meio de cultura contendo vitaminas termolábeis foi esterilizado por autoclave. Está certo este procedimento?

Não, este procedimento não está correto. As vitaminas, sendo termolábeis, perderiam suas estruturas e propriedades quando expostas a altas temperaturas na autoclave. A técnica ideal para esterilizar qualquer substância termolábil é a filtração, que remove os microrganismos sem a necessidade de calor, preservando a integridade dos componentes sensíveis.

11. Formação de Biofilme Oral: Etapas e Estruturas Chave

Qual é a etapa essencial para a formação de biofilme oral?

A etapa essencial para a formação de biofilme oral é a adesão inicial dos microrganismos à superfície do dente ou outra estrutura oral, seguida pela produção de substâncias poliméricas extracelulares (EPS).

Quais as estruturas importantes para formar o biofilme oral?

As estruturas importantes para a formação do biofilme oral incluem:

• Polissacarídeos Extracelulares (EPS): Além de promoverem a aderência, mantêm a integridade do biofilme, retêm enzimas extracelulares, previnem a desidratação e o ataque por agentes nocivos, e aglutinam nutrientes essenciais, o que favorece o desenvolvimento de microrganismos.
• Glicocálix (ou Glicocálice): Região rica em carboidratos localizada na superfície externa da célula que auxilia na captação de nutrientes próximos às células, permite a ligação entre as células e a adesão às superfícies.
• Pili (ou Fímbrias): Filamentos longos e delgados que promovem a adesão das bactérias à superfície, prevenindo contra a ação mecânica da saliva, líquidos e alimentos.

12. Impacto da Inversão de Corantes na Coloração de Gram

Coloração de Gram: o que acontece se trocar o corante primário com o secundário?

Se houver a troca do corante primário (Cristal Violeta) com o secundário (Safranina) na coloração de Gram, ocorrerá uma inversão das cores esperadas:

• Bactérias Gram-positivas: Seriam coradas de rosa/vermelho (pela safranina) e não reteriam o cristal violeta na etapa de descoloração, resultando em uma coloração incorreta.
• Bactérias Gram-negativas: Seriam coradas de roxo/azul (pelo cristal violeta) e não seriam contracoradas pela safranina, também resultando em uma coloração incorreta.

Isso comprometeria completamente a diferenciação e a identificação correta das bactérias.

13. Técnica de Esgotamento para Obtenção de Culturas Puras

A técnica de esgotamento é muito utilizada em microbiologia para a obtenção de culturas puras.

Em que se baseia este método e o que deve ser feito para a obtenção de uma cultura pura?

A cultura pura é o crescimento de bactérias idênticas da mesma espécie em um meio nutritivo adequado. A técnica de esgotamento consiste em espalhar, com o auxílio de uma alça de inoculação estéril, uma porção de suspensão de microrganismos na superfície de uma placa com meio nutritivo, de forma que fiquem espalhadas em 3 ou mais direções diferentes, diminuindo progressivamente a concentração de células. O objetivo é que, ao final, algumas células fiquem separadas umas das outras. As células isoladas formarão colônias distintas após um tempo de incubação.

Para a obtenção de uma cultura pura, após o procedimento de esgotamento, deve-se retirar com uma agulha de inoculação flambada e resfriada uma porção de uma única colônia isolada e transferi-la para um tubo de ágar inclinado ou outro meio nutritivo adequado. A pureza da colônia será observada através de seu aspecto homogêneo. Finalmente, é recomendável realizar uma coloração de Gram a partir dessa nova cultura para confirmar a pureza e a morfologia de todas as células observadas.

14. Transferência Genética em Bactérias: Horizontal vs. Vertical

• Transferência Horizontal de Genes (THG): É um processo em que um organismo transfere material genético para outra célula que não é sua descendente direta. Isso pode ocorrer por transformação, transdução ou conjugação. É um mecanismo importante para a evolução bacteriana e a disseminação de características como resistência a antibióticos.
• Transferência Vertical de Genes: Por contraste, ocorre quando um organismo recebe material genético de seu antecessor, por exemplo, dos pais para os filhos durante a reprodução (fissão binária nas bactérias). É o modo tradicional de herança genética.

16. Testes Bioquímicos em Microbiologia: Objetivos e Resultados

a) Qual o objetivo da prova do nitrato?

A prova do nitrato identifica microrganismos que possuem a enzima nitrato-redutase, capaz de reduzir o nitrato (NO₃⁻) a nitrito (NO₂⁻). A redução é mediada por esta enzima, e o nitrito reage com os reveladores (alfa-naftilamina e ácido sulfanílico) resultando em uma coloração avermelhada. Caso não fique vermelho, para dar veracidade ao teste, é necessária a adição de pó de zinco, que é um redutor de nitrato. Se após a adição do zinco a cor virar para vermelho, o teste original será obrigatoriamente negativo (pois o nitrato só foi reduzido pelo zinco, não pela bactéria).

b) Qual o objetivo da prova de SIM?

A prova de SIM (Sulfeto, Indol, Motilidade) analisa três características bioquímicas simultaneamente:

• Produção de Sulfeto de Hidrogênio (H₂S): Permite determinar a capacidade dos microrganismos para produzirem ácido sulfídrico a partir de substratos como aminoácidos sulfurados ou compostos sulfurados inorgânicos.
• Produção de Indol: Determina a capacidade do microrganismo de degradar o aminoácido triptofano até indol.
• Motilidade da Bactéria: Observa se os microrganismos se deslocam da linha de inoculação, turvando o meio.

c) Qual o significado da mudança de cor do indicador de pH (para rosa) na prova de fermentação da glicose?

A mudança de cor do indicador de pH para rosa (ou outra cor ácida, dependendo do indicador específico) na prova de fermentação da glicose indica que ocorreu a fermentação da glicose. Isso se deve à produção de ácidos como produtos finais do metabolismo da glicose, o que causa um abaixamento do pH do meio.

17. Classificação Bacteriana e Metabolismo em Relação ao Oxigênio

As bactérias podem ser classificadas quanto à necessidade de oxigênio para seu crescimento da seguinte forma:

• Aeróbias Estritas: Requerem oxigênio para crescer, utilizando-o como aceptor final de elétrons na respiração celular aeróbia.
• Anaeróbias Estritas: Não toleram oxigênio e morrem em sua presença, realizando metabolismo anaeróbio (fermentação ou respiração anaeróbia).
• Anaeróbias Facultativas: Crescem tanto na presença quanto na ausência de oxigênio. Preferem oxigênio (respiração aeróbia), mas podem realizar fermentação ou respiração anaeróbia na sua ausência.
• Microaerófilas: Requerem oxigênio, mas em concentrações muito baixas (menores que as atmosféricas).
• Aerotolerantes: Não utilizam oxigênio para o crescimento, mas podem sobreviver em sua presença, realizando apenas metabolismo anaeróbio.

Correlação com o tipo de metabolismo microbiano:

• A respiração celular aeróbia se trata da obtenção de energia a partir de reações químicas com o envolvimento do oxigênio como aceptor final de elétrons, como ocorre em diversos eventos da fosforilação oxidativa. A energia é proveniente da molécula de ATP.
• A respiração celular anaeróbia se trata da obtenção de energia a partir de reações químicas sem o envolvimento do oxigênio, utilizando outros compostos inorgânicos (como nitrato, sulfato) como aceptores finais de elétrons.
• A fermentação é um processo anaeróbico de produção de energia. Ela é utilizada por fungos e bactérias que vivem em ambientes pobres em oxigênio. A fermentação difere da respiração celular, pois seu aceptor final de elétrons é um composto orgânico e não uma molécula externa como o oxigênio. Entretanto, a fermentação também utiliza moléculas de glicose como fonte de energia e se inicia da mesma forma que a respiração celular, com a glicólise.

18. Parede Celular e Ribossomos: Alvos Cruciais de Antibacterianos

A parede celular e os ribossomos são considerados importantes alvos de ação de antibacterianos por várias razões, principalmente devido à toxicidade seletiva, ou seja, a capacidade de afetar as células bacterianas sem causar danos significativos às células do hospedeiro.

• Parede Celular: É um excelente alvo porque é uma estrutura essencial para a sobrevivência bacteriana, mas está ausente nas células eucarióticas humanas. A parede celular confere conformação celular, protege a membrana citoplasmática de alterações adversas do ambiente externo, previne a ruptura das células bacterianas quando a pressão de água interna é maior que a externa, serve como ponto de ancoragem para flagelos e contribui para a capacidade de algumas bactérias causarem doenças. Sua composição química (peptidoglicana com ligações peptídicas cruzadas) é única das bactérias, tornando-a um alvo altamente específico para antimicrobianos como os beta-lactâmicos, que inibem sua síntese.
• Ribossomos: Os ribossomos bacterianos (70S) são estruturalmente diferentes dos ribossomos eucarióticos (80S). Essa diferença permite que antibióticos, como os aminoglicosídeos e tetraciclinas, se liguem especificamente às subunidades ribossomais bacterianas (30S ou 50S), impedindo a síntese de proteínas essenciais para a bactéria, sem afetar significativamente a síntese proteica nas células humanas. Os antibióticos aminoglicosídicos, por exemplo, apresentam efeito bactericida por ligarem-se especificamente à subunidade 30S dos ribossomos bacterianos, impedindo o movimento do ribossomo ao longo do mRNA e, consequentemente, interrompendo a síntese de proteínas.

19. Diferenças nas Paredes Celulares de Bactérias Gram-Positivas e Gram-Negativas

• Bactérias Gram-Positivas: Possuem uma camada espessa de parede celular composta por uma densa rede de peptidoglicana, formando uma estrutura espessa e rígida. Apresentam também ácidos teicoicos, que são polímeros de glicerol ou ribitol fosfato. Existem duas classes: ácidos lipoteicoicos, que atravessam a camada de peptidoglicana e estão ligados à membrana plasmática, e os ácidos teicoicos da parede, que estão ligados diretamente à camada de peptidoglicana.
• Bactérias Gram-Negativas: Possuem uma camada fina de parede celular, composta por uma camada de peptidoglicana muito mais delgada, que é recoberta por uma membrana externa. A parede celular das Gram-negativas não contém ácidos teicoicos. A membrana externa é composta por lipopolissacarídeos (LPS), lipoproteínas e fosfolipídios, e atua como uma barreira adicional, dificultando a entrada de certas substâncias e antibióticos.