Microbiologia Essencial: Métodos, Bactérias e Patogenia

Métodos de Esterilização e Desinfecção

Fervura

• Temperatura de 100°C.
• Elimina formas vegetativas.
• Imersão por 10 a 20 minutos em água fervente.
• Pode prejudicar instrumentos cortantes.
• Endósporos e alguns vírus não são destruídos rapidamente.
• Considerado por alguns autores como método de desinfecção.

Autoclave

• Vapor sob pressão em temperaturas de 121 a 123°C.
• 121°C por 15 minutos ou 115°C por 45 minutos.
• Poder de penetração superior ao calor seco.
• Método preferencial de esterilização.
• Utilizado para esterilizar materiais que não sofram oxidação, como líquidos, algodão, meios de cultura, instrumentos.
• O vapor deve entrar em contato e penetrar em todos os materiais a serem esterilizados.

Pasteurização

• Desnaturação das proteínas.
• Temperaturas de esterilização têm efeitos adversos em muitos alimentos.
• Utiliza o aquecimento lento a baixas temperaturas por um longo tempo.
• Inativa quase todos os vírus patogênicos e elimina as células vegetativas de microrganismos patogênicos ou não.
• Considerado como um método de desinfecção.

Calor Seco

Flambagem

• Incineração ou exposição direta à chama (bico de Bunsen ou lamparinas).
• Esteriliza a alça ou fio de metal (Níquel-cromo ou platina).
• Incineração: esteriliza e elimina papel, copos, sacos, bandagens contaminadas, carcaças.
• Cuidados com gotículas e aerossóis.

Fornos (Pasteur)

• Método mais utilizado.
• Indicado para instrumentos que sofrem algum dano pelo vapor sob pressão.
• 160-180°C por um período não inferior a duas horas.
• Períodos de tempo maiores e temperaturas mais elevadas são necessários, pois o calor na água é mais prontamente transferido a um corpo frio do que o calor no ar.

Processo de Coloração de Gram

1. Cubra o esfregaço com cristal violeta e deixe por aproximadamente 1 minuto.
2. Escorra o corante e lave em um filete de água corrente.
3. Cubra a lâmina com lugol e deixe agir por aproximadamente 1 minuto.
4. Escorra o lugol e lave em um filete de água corrente.
5. Adicione álcool-acetona sobre a lâmina, descorando-a, até que não desprenda mais corante.
6. Lave em um filete de água corrente.
7. Cubra a lâmina com safranina e deixe agir por aproximadamente 30 segundos.
8. Lave em um filete de água corrente.
9. Deixe secar ao ar livre.
10. Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço.
11. Leia em objetiva de imersão (100X).

Curva de Crescimento Bacteriano

• Fase de Declínio ou Morte (D): Taxa de crescimento negativo: o número de células mortas supera o de células novas. Células viáveis decrescem exponencialmente.
• Fase Lag (A): Taxa de crescimento zero: há pouca ou nenhuma multiplicação. Fase de adaptação das bactérias ao meio. Pode variar de 1h a dias. Envolve duplicação do DNA e síntese de enzimas, rRNA.
• Fase Log ou Exponencial (B): Taxa de crescimento positiva: multiplicação intensa. As células estão mais ativas metabolicamente, mas também mais suscetíveis a alterações do meio. População mais uniforme.
• Fase Estacionária (C): Taxa de crescimento zero: o número de mortes equivale ao das novas células (população estável). Atividade metabólica reduzida. Exaustão dos nutrientes. Produção de compostos tóxicos. Alteração no pH.

Transferência Genética Bacteriana

Transformação

Na transformação, a bactéria absorve moléculas de DNA dispersas no meio e as incorpora à cromatina. Esse DNA pode ser proveniente, por exemplo, de bactérias mortas. Esse processo ocorre espontaneamente na natureza.

Transdução

Na transdução, moléculas de DNA são transferidas de uma bactéria a outra usando vírus como vetores (bacteriófagos). Estes, ao se montar dentro das bactérias, podem eventualmente incluir pedaços de DNA da bactéria que lhes serviu de hospedeira. Ao infectar outra bactéria, o vírus que leva o DNA bacteriano o transfere junto com o seu. Se a bactéria sobreviver à infecção viral, pode passar a incluir os genes de outra bactéria em seu genoma.

Conjugação

Na conjugação bacteriana, pedaços de DNA passam diretamente de uma bactéria doadora, o "macho", para uma receptora, a "fêmea". Isso acontece através de microscópicos tubos proteicos, chamados pili, que as bactérias "macho" possuem em sua superfície. O fragmento de DNA transferido se recombina com o cromossomo da bactéria "fêmea", produzindo novas misturas genéticas, que serão transmitidas às células-filhas na próxima divisão celular.

Resistência à Penicilina

O principal mecanismo de resistência de bactérias às penicilinas baseia-se na produção de beta-lactamases, enzimas que degradam a penicilina, impedindo sua ação. Outro mecanismo de ação da penicilina é a inativação do inibidor das enzimas autolíticas na parede celular. Isso resulta na lise celular. As bactérias adquirem resistência às penicilinas por inativação enzimática pelas beta-lactamases biossintetizadas pelas bactérias, redução da permeabilidade da parede celular bacteriana às penicilinas (que assim não conseguem alcançar seus locais de ligação representados por proteínas específicas), alterações conformacionais nessas proteínas de ligação das penicilinas bloqueando as atividades antibióticas, e o aparecimento do fenômeno de tolerância.

Fatores de Virulência

São características fenotípicas que capacitam o microrganismo a causar a doença, condicionadas pelo genótipo do agente.

• Fixação: Receptores e adesinas, Fímbrias bacterianas (Pili).
• Patógenos Intracelulares: Obrigatórios e Facultativos.
• Cápsulas.
• Flagelos.
• Exoenzimas.
• Toxinas: Endotoxinas e Exotoxinas.

Exotoxinas

São uma espécie de veneno que determinadas bactérias fabricam e segregam continuamente, de modo a difundirem-se pelo organismo, por exemplo, através dos líquidos orgânicos, sobretudo pelo sangue, e chegarem a setores mais ou menos afastados da porta de entrada. Cada uma das espécies bacterianas produtoras de exotoxinas fabrica uma substância nociva específica, cujos efeitos provocam as manifestações da doença infecciosa provocada pelo microrganismo em questão. É preciso referir que algumas exotoxinas, como as elaboradas pelas bactérias responsáveis pelo tétano, são tão potentes que podem ser letais, mesmo que o número de microrganismos provocadores da infecção seja reduzido.

Características das Exotoxinas

• Liberada pela bactéria.
• Proteína ou polipeptídeo.
• Gram-positivas e negativas.
• Efeito específico único.
• Letal em pequenas quantidades (1 mg é suficiente para matar um milhão de cobaias).
• Antigênica.
• Pode ser convertida em toxoide.

Endotoxinas

São aglomerações pertencentes à estrutura de algumas bactérias, que apenas são libertadas após a destruição dos microrganismos. Os seus efeitos são menos potentes do que os das exotoxinas e, normalmente, correspondem aos típicos dos processos infecciosos, como a subida de temperatura do corpo e alterações na circulação sanguínea.

Características das Endotoxinas

• Parte da parede celular.
• Lipopolissacarídeo: Lipídio A.
• Gram-negativas.
• Efeito inespecífico.
• Letal em quantidades maiores.
• Não antigênica.
• Não conversível a toxoide.

Diferença entre Bactérias Gram-Positivas e Gram-Negativas

As paredes celulares das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas são diferentes. A parede celular da bactéria Gram-positiva é espessa, de 10 a 50 micrômetros, chegando até a 80 micrômetros, e a da Gram-negativa é menos espessa, com 7,5 a 10 micrômetros. A membrana citoplasmática adere fortemente ao componente interno da célula bacteriana. A parede celular da bactéria Gram-positiva é única e consiste de uma camada espessa, composta quase que completamente por peptidoglicano, responsável pela manutenção da célula e sua rigidez. As múltiplas camadas de peptidoglicano (15 a 50 micrômetros) das bactérias Gram-positivas constituem uma estrutura extremamente forte em tensão, enquanto nas Gram-negativas o peptidoglicano é apenas uma camada espessa e, consequentemente, frágil.

Reprodução Sexuada e Assexuada (Fungos)

A reprodução assexuada pode ocorrer por fragmentação do micélio (cada fragmento origina um novo organismo) ou pela produção de esporos assexuais (zoósporos, conidiósporos e uredósporos) formados pelas transformações do sistema vegetativo sem ocorrer fusão de gametas. Já os esporos sexuais (gametas) são resultantes da união do gametângio feminino (oogônia) com o gametângio masculino (anterídio), que passam por sucessivas etapas de meiose e mitose.

Isolamento de Fungos

O isolamento de fungos pode ser feito diretamente a partir de algum substrato ou de um compartimento ambiental (ar, água, solo), utilizando vidraria (tubos de ensaio, placas de Petri) e instrumentos (estiletes, pinças, agulhas) esterilizados, com a manipulação em uma zona de segurança próximo a uma chama e/ou em uma câmara de fluxo laminar. Para que ocorra o isolamento dos fungos, é necessário oferecer condições propícias para o desenvolvimento dos mesmos. O isolamento pode ser realizado a partir de câmaras úmidas (recipiente semifechado com fonte de umidade, ex: placas de Petri forradas com papel filtro embebido com água destilada estéril) ou a partir de um meio de cultura sólido ou líquido, semissintético ou sintético (ex: tubos de ensaio ou placas de Petri contendo meio de cultura).

Multiplicação e Disseminação no Hospedeiro

Infecção > Superfície dos órgãos (Inoculação) > Linfonodos > Viremia Primária > Órgãos > Viremia Secundária > Órgãos "Alvo".

Etapas da Patogenia das Doenças Infecciosas

Entrada do agente > Fixação do patógeno a algum tecido (tropismo) > Multiplicação > Invasão ou disseminação > Evasão das defesas > Danos aos tecidos do hospedeiro.