PIP2: Localização e Hidrólise em Cavéolas

Localização e Turnover do Fosfatidilinositol 4,5-Bifosfato (PIP2) em Cavéolas

Introdução

Cavéolas são pequenas invaginações que correspondem a aproximadamente 1% da membrana plasmática e que estão envolvidas com sinalização celular. As cavéolas são um sítio específico para a proteína **caveolina**, que provavelmente tem função estrutural nesse domínio de membrana plasmática. Além disso, cavéolas também são ricas em **glicoesfingolipídeos** e **colesterol**, o que as torna resistentes à solubilização com o detergente específico **Triton X-100**.

Estudos demonstram que nas cavéolas existe uma grande porção do total celular de **fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2)** e que esse lipídio, quando localizado nas cavéolas, está sujeito a alterações em respostas a fatores de crescimento, **bradicinina** ou hormônios. São essas as características das cavéolas que serão analisadas no experimento a seguir.

Materiais e Métodos

Os materiais utilizados para os experimentos foram:

• Meio de cultura utilizado para células de mamíferos (DMEM).
• Anticorpos anti-caveolina, anti-actina e anti-receptores hormonais, para possibilitar a identificação das cavéolas, das frações referentes ao citoesqueleto e dos receptores presentes nas cavéolas.
• Detergente Triton X-100, no qual as cavéolas são insolúveis, o que permite seu isolamento.
• Inositol marcado com trítio ([³H]).
• Kit de quimiluminescência para identificação dos fosfolipídios de inositol nas células.

Primeiramente, as cavéolas foram marcadas com inositol possuidor de trítio e então estimuladas pela adição de **fator de crescimento epitelial (EGF)** e bradicinina. Depois, as cavéolas foram solubilizadas e lisadas pela ação do detergente, além de sofrerem centrifugação por gradiente de densidade. As frações resultantes foram analisadas e, assim, as cavéolas foram isoladas.

Os fosfolipídios de inositol presentes nas células foram analisados por meio da localização dos inositois marcados. Eles foram submetidos à **cromatografia em camada fina** e essa camada foi submetida, em seguida, à **autorradiografia** que, por meio do isótopo radioativo trítio, identificou bandas correspondentes aos diferentes fosfolipídios de inositol presentes nas células.

A hidrólise do **fosfatidilinositol bifosfato** foi monitorada por meio da marcação do inositol com trítio e, em seguida, da adição de EGF e bradicinina. As concentrações de fosfatidilinositol bifosfato foram alteradas pelo estímulo.

As frações obtidas pela centrifugação passaram por **Immunoblotting** (técnica de separação por eletroforese juntamente com método de detecção de anticorpos) e foram separadas por densidade em gradientes de sacarose, tornando possível a análise das proteínas e a identificação da **caveolina**, da **actina** e dos **receptores hormonais**.

Resultados

A maioria das proteínas obtidas na centrifugação em gradiente de sacarose estava concentrada nas frações 9, 10 e *pellet*. Na fração 4 houve a formação de uma banda insolúvel ao Triton X-100, sugerindo que a **fração 4** poderia corresponder à região das cavéolas.

Ao serem tratadas com anticorpos e submetidas à eletroforese, as células mostraram a presença de grande quantidade de **caveolina na fração 4** e de actina e de receptores de EGF nas frações 9 e 10. Logo, confirmou-se a hipótese de que a fração 4 corresponde à cavéola e as frações 9 e 10 correspondem às regiões citosólicas e membranares. O experimento também mostrou a presença de caveolina na fração *pellet*, **consequência** da provável associação das cavéolas a microfilamentos e actina, o que possibilitaria a invaginação.

Também foi possível identificar a distribuição dos diferentes tipos de fosfatidilinositol na célula. A análise do **fosfatidilinositol**, **liso-fosfatidilinositol**, **fosfatidilinositol monofosfato** e **fosfatidilinositol bifosfato** marcados com trítio e submetidos à cromatografia e à autorradiografia garantiu que o fosfatidilinositol e o liso-fosfatidilinositol prevaleciam nas frações 9 e 10, enquanto o fosfatidilinositol monofosfato e o fosfatidilinositol bifosfato estavam concentrados na **fração 4 (Cavéolas)**.

Nas células, os efeitos do EGF são mediados pelos receptores de EGF, pertencentes à família de receptores **tirosina-quinases**, enquanto os efeitos da bradicinina são mediados por receptores associados à **proteína G**. O tratamento das células com esses hormônios induz a um aumento (de duas vezes no caso do EGF e de três vezes no caso da bradicinina) na produção de **inositol fosfato**, um produto da hidrólise de fosfatidilinositol.

Também se desejava determinar o local de hidrólise do fosfatidilinositol. Os resultados mostraram que as concentrações de fosfatidilinositol ou liso-fosfatidilinositol nas frações subcelulares não foram alteradas pelo EGF ou pela bradicinina. Porém, **esses** hormônios promoveram uma notável diminuição na concentração de **fosfatidilinositol bifosfato na fração 4**, enquanto nas frações 9 e 10 a concentração permaneceu praticamente constante.

Outros três experimentos foram realizados: a medição da quantidade de fosfatidilinositol retida nas áreas solúveis e insolúveis da solução em relação ao Triton X-100, o **Western Blot** e a medição da concentração de fosfatidilinositol bifosfato nas frações após a adição de EGF e bradicinina. **Western Blot** é uma técnica que consiste basicamente da eletroforese em gel de proteínas desnaturadas por massa e a transferência para uma membrana onde são usados anticorpos específicos às proteínas. O resultado foi a caveolina e uma grande porcentagem de fosfatidilinositol bifosfato retidos na **fração insolúvel do Triton X-100**, sendo que a adição de hormônios reduziu a concentração desse fosfatidil na fração insolúvel e manteve constante a concentração na fração solúvel.

A confiabilidade dos resultados é garantida pela alta taxa de recuperação dos lipídios e pela distribuição constante de proteínas, caveolina, actina e receptores EGF, apesar dos diversos experimentos.

Discussão

Uma análise dos resultados mostra que o **fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2)** se encontra altamente compartimentalizado no interior das células, sendo que aproximadamente metade desse lipídio se encontra nas cavéolas distribuído de forma não uniforme. Além disso, a porcentagem de PIP2 nas cavéolas em relação ao seu total nas células é bem maior do que a porcentagem do fosfatidilinositol, liso-fosfatidilinositol e fosfatidilinositol monofosfato.

Contudo, como o fosfatidilinositol é importante para a sinalização celular por meio de sua fosforilação em fosfatidilinositol 4,5-bifosfato, ele está presente em maior quantidade nas células e mesmo nas cavéolas do que o fosfatidilinositol 4,5-bifosfato.

A presença de fosfatidilinositol na membrana plasmática para sua provável fosforilação se dá por meio das cavéolas, que o transportam do seu local de síntese, o **retículo endoplasmático**, até a membrana. Além disso, foi observada uma rota de caveolina entre o **Complexo de Golgi**, o retículo endoplasmático e a membrana plasmática, o que confirma essa hipótese.

Outro ponto importante é a hidrólise do fosfatidilinositol 4,5-bifosfato na presença de bradicinina e EGF e sua **consequente** recuperação lenta após essa hidrólise. Isso indica que a sinalização envolvendo a ativação da **fosfolipase C-gama** via tirosina quinase, e a ativação da **fosfolipase C-beta** por receptores de proteína G acontecem na cavéola e têm como resultado a hidrólise desse lipídio. Ou seja, os receptores para **inositol trifosfato** também estão concentrados nas cavéolas, mostrando que a resposta para um estímulo extracelular também é algo muito compartimentalizado, além da localização das moléculas envolvidas na sinalização celular ser algo totalmente específico e decisivo para a comunicação intracelular.