Técnicas de Confecção de Lâminas Histológicas: Guia Completo

Introdução à Histologia

• É a ciência que estuda os tecidos e como estes se organizam para constituir órgãos.
• Faz parte da Anatomia Microscópica.
• O termo Histologia foi usado pela primeira vez em 1819 por Mayer, que aproveitou o termo tecido instituído por Bichat (anatomista francês) muito tempo antes (por volta de 1800).

O que é Tecido?

Conjunto de células que apresentam a mesma forma, função e origem embrionária.

Técnicas Utilizadas em Histologia

• Confecção de Lâminas Histológicas: Coleta, Fixação, Inclusão e Microtomia.
• Para a análise sob microscopia óptica, é necessária a confecção de lâminas delgadas dos tecidos que formam os órgãos.
• Estas lâminas podem ser permanentes ou provisórias.

1 - Coleta do Material

• Partes de órgãos são retiradas com o auxílio de um bisturi, pinça ou lâmina de barbear.
• Não é indicada a extração de porções grandes.

2 - Fixação

Consiste na utilização de procedimentos físicos ou químicos para imobilizar as substâncias constituintes das células e dos tecidos, fornecendo maior resistência para suportar as demais etapas.

Os agentes fixadores mais utilizados fixam as proteínas, evitando sua degradação: Formol tamponado e Líquido de Bouin.

O formol, acessível e de uso simples, é o fixador mais utilizado nas técnicas histológicas. Contudo, seus resultados geralmente não são satisfatórios, sendo recomendada a dissolução de formol em tampão fosfatado.

Fórmula do Formol Tamponado:

• Formol (solução a 37% de formaldeído): 100 ml
• Água destilada: 900 ml
• Fosfato de sódio monobásico: 4,0 g
• Fosfato de sódio dibásico (anidro): 6,5 g

O tempo de fixação pode variar entre 6 e 24 horas. Uma vez fixada, a peça deve ser transferida para álcool 70%, onde poderá permanecer indefinidamente.

Fórmula do Fixador de Bouin:

• Solução aquosa saturada de ácido pícrico: 75 ml
• Formol: 25 ml
• Ácido Acético: 5 ml

Após a fixação, é fundamental a remoção do ácido pícrico dos tecidos para a posterior etapa de coloração.

Eliminação do Excesso de Fixador:

1. Lavagem em água corrente por 18 horas;
2. Transferência da peça para álcool 50%, durante 30 minutos;
3. Armazenamento da peça em álcool 70%.

3 - Desidratação

Visa retirar a água dos tecidos, a fim de permitir a impregnação da peça com parafina.

Para isso, a peça é submetida a banhos sucessivos em álcoois de teor crescente (ex.: álcool a 70%, 80%, 90% e 100%).

4 - Diafanização

Visa impregnar a peça com um solvente de parafina, substituindo o álcool presente nos tecidos por xilol (agente clarificador).

5 - Impregnação pela Parafina Fundida

Tem a finalidade de permitir a obtenção de cortes suficientemente finos para serem observados ao microscópio.

Para isso, os tecidos devem ser submetidos a banhos de parafina a 60°C, no interior da estufa.

Em estado líquido, a parafina penetra nos tecidos, dando-lhes, depois de solidificada, certa dureza.

6 - Inclusão

Este procedimento consiste na impregnação do tecido com uma substância de consistência firme que permita, posteriormente, seccioná-lo em camadas delgadas.

O tecido é colocado em suportes metálicos cheios de parafina líquida, que, depois de solidificar à temperatura ambiente, dá origem ao chamado bloco de parafina.

7 - Microtomia

É a etapa em que se obtêm delgadas fatias de peças incluídas na parafina.

A espessura dos cortes geralmente varia de 5 a 10 µm (micrômetros). (1 µm = 0,001 mm)

8 - Extensão (Estiramento)

Para desfazer as rugas, os cortes são esticados num banho de água e gelatina a 58°C e “pescados” com uma lâmina.

O processo de colagem do corte à lâmina, pela coagulação da gelatina, segue as seguintes etapas:

• Colocam-se as secções a flutuar em banho-maria;
• Colocam-se os cortes numa lâmina;
• Levam-se à estufa a 37°C, por 2 horas, para secagem e colagem.

9 - Coloração

Tem a finalidade de dar contraste aos componentes dos tecidos, tornando-os visíveis e destacados uns dos outros (ex.: cor rosa).

Para realizá-la, são observados 3 itens:

1. Eliminação da Parafina: Por meio de banhos sucessivos em xilol, benzol ou toluol.
2. Hidratação: É executada quando o corante utilizado é solúvel em água. Deve ser gradativa, com álcoois de teor decrescente, para evitar o rompimento dos tecidos.
3. Coloração.

10 - Desidratação (Pós-Coloração)

Visa retirar a água, quando os corantes utilizados forem soluções aquosas, a fim de permitir a perfeita visualização dos tecidos, pois a água possui índice de refração diferente do vidro, e ainda prevenir a difusão dos corantes. Para isso, usam-se banhos em álcoois de teor crescente.

11 - Diafanização

A diafanização é feita com xilol, a fim de tornar os cortes perfeitamente transparentes.

12 - Montagem

É a etapa final da técnica histológica, e consiste na colagem da lamínula sobre o corte, utilizando Bálsamo do Canadá, que é solúvel em xilol e insolúvel em água.

A lamínula impede que haja hidratação do corte pela umidade do ar ambiente, permitindo que estas lâminas se mantenham estáveis por tempo indefinido. Após a montagem, as lâminas são levadas à estufa para secagem do Bálsamo do Canadá.

Técnicas Especiais

Técnicas Utilizadas para Confecção de Lâminas Ósseas

• Consiste no desgaste do osso através do polimento com lixa.
• A segunda técnica implica na descalcificação do osso.
• A descalcificação pode ser feita através da imersão em ácidos ou compostos quelantes.

Técnica de Criomicrotomia (Microtomia por Congelamento)

• O congelamento ocorre por expansão de CO2.