Técnicas de PCR e Transcriptase Reversa: Conceitos e Aplicações

• Os métodos se baseiam na replicação de DNA que utiliza uma enzima dependente de iniciadores que funciona na direção 5'-3'

• O genótipo GG apresenta 2 bandas no gel; o genótipo GA tem 3 bandas e o genótipo AA tem 1 banda 

• PCR é um método mais sensível que microarranjo  

• Primer senso: 5'- CCACGTGCGCCTTATAGCCT-3'e primer antisenso 5'-ACTCTTTGCATTTGCAGGAG-3'

• 280 bp

• Sim, embora degradado, há algum DNA nos bulbos capilares que pode ser utilizado 

• PCR par regiões variáveis curtas, STRs (short tandem repeats)

• Os pesquisadores precisam isolar RNA, fazer um RT-PCR com iniciadores específicos, ligar o produto de PCR a uma plasmídeo e transformar o plasmídeo com fragmento de PCR em uma bactéria para expressão da proteína recombinante

  1. Colocar o gene da recombinase sob o comando de um promotor oriundo de um gene expresso apenas no tecido alvo

• O gene pode ser regulado no nível genético e epigenético para contribuir para o fenótipo

• um fragmento de DNA responsável pela síntese de um antígeno é inserido em um plasmídeo, a partir das técnicas de DNA recombinante e transformado em bactérias. A proteína é purificada após ter a expressão induzida nas bactérias e injetada nos camundongos disparando a resposta imune

• altamente conservado para permitir comparação de inúmeras espécies, onde poucas variações seriam suficientes para permitir o agrupamento. 

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• métodos de extração e purificação de DNA, amplificação de DNA, construção de bibliotecas de DNA, sequenciamento de segunda geração e bioinformática

• Colocar o gene da recombinase sob o comando de um promotor oriundo de um gene expresso apenas no tecido alvo

• No cromossomo Y e na Mitocôndria

• Temperatura de anelamento

• técnicas que não dependem de PCR RISA e FISH

• 3 alguns parâmetros são usados pelo programa para determinar o melhor par de primer - Temperatura de melting e tamanho do primer

• Como ocorre a transcriptase reversa?

  A transcriptase reversa é uma enzima, também denominada DNA-polimerase ou RNA-dependente, responsável por realizar o processo de transcrição, que corresponde a uma “cópia invertida”, de modo ao contrário em relação ao padrão celular. Em outras palavras, essa enzima polimeriza moléculas de DNA a partir de moléculas de RNA, o oposto do que comumente ocorre nas células.

  É exatamente devido ao fato dessa enzima agir de modo “reverso”, que certos vírus como o HIV, entre outros, são chamados de retrovírus. Esses vírus injetam o seu material genético na célula hospedeira através da ajuda da enzima em questão utilizam os nucleotídeos presentes no citoplasma da célula para montar uma fita de DNA usando de base o seu material genético (a fita de RNA). Deste modo, o maquinário da célula hospedeira irá reconhecer a fita de DNA, que acabara de ser produzida, como não sendo estranha e, consequentemente, não a destruirá. Já a molécula de RNA do vírus será destruída pela enzima RNAse-H, por meio do processo de hidrólise.

• O elucidamento desse processo permitiu o desenvolvimento da tecnologia da PCR (reação em cadeira da polimerase), que é um método de amplificação de DNA a partir de molecular (moldes) de RNA, que recebe o nome de RT-PCR (transcrição reversa – PCR).

  O que é um gene?

  O Encode (Enciclopédia de Elementos do DNA) define gene como uma sequencia do genoma onde algum produto funcional é gerado, e se houverem sequencias sobrepostas, a união destas é o gene.

  O que é DNA?

  É um complexo de moléculas que contém todas as informações necessárias para construir e manter um organismo

• Porque o DNA não tem Uracila?

  A Timina é praticamente igual a Uracila quanto a fórmula estrutural molecular. Além disso, Timina, Citosina e Uracila são bases nitrogenadas do tipo pirimidina, sendo muito parecidas, se tivesse Uracila no DNA, consequentemente teríamos vários erros durante a replicação (duplicação) da molécula. A Timina é uma base nitrogenada de 5'-metil-uracila como você pode ver na imagem abaixo.

  Este radical metil auxilia na proteção da molécula de DNA. Além disso, o mecanismo de desaminação (retirada de um radical amina) da Citosina forma a Uracila e isto é um importante mecanismo de reparo para o DNA. Tiramos disso que o DNA é uma molécula que tem que ser mais conservada, já que é o DNA que conserva a informação genética que deve ser preservada para manter as funções vitais do organismo. O RNA é apenas uma molécula para construir os produtos destas informações contidas no DNA. São muitas moléculas de RNA produzidas a todo momento e que são desintegradas rapidamente e recicladas pela célula. Esta é uma das funções mais importantes na troca de base nitrogenada que vai formar o nucleotídeo que compõe as duas moléculas.

  Outra coisa que podemos acrescentar é que a Uracila, por não ter um radical como as moléculas de Citosina ou Timina, podem acabar se ligando com diversas bases nitrogenadas sem seguir o pareamento clássico (A/T(U) e C/G). Isso só acontece na molécula de RNA e é isto que torna este ácido nucleico mais maleável na sua estrutura tridimensional, sendo possível encontrar diferentes tipos de RNA na célula.

Conceito de PCR e cite duas fases no PCR

A PCR (Reação de Polimerização em Cadeia) é uma metodologia que se baseia na amplificação exponencial selectiva de uma quantidade reduzida de DNA de uma única célula.

O objetivo da PCR é produzir uma quantidade apreciável de um segmento específico de DNA a partir de uma quantidade mínima. O DNA molde sofre uma amplificação controlada por enzimas, obtendo-se milhões de cópias do fragmento de DNA de interesse.

Um ciclo de PCR (Fig.1) consiste em três fases: desnaturação do DNA molde (a 95°C), ligação (“annealing”) dos primers (a 64°C) e polimerização do DNA (a 72°C). Na 1ª etapa faz-se a separação das cadeias de dupla hélice de DNA através do calor. Esta separação é essencial para que, na 2ª fase, dois primers de oligonucleotídeos se liguem às sequências dos pares de bases complementares da cadeia molde. Estes primers são desenhados e sintetizados de modo a ligarem-se às extremidades opostas de cada uma das cadeias de DNA molde que se pretende amplificar. Os primers servem, portanto, de ponto de partida para a replicação de DNA e, na última etapa, faz-se a sua extensão. A enzima responsável por esta polimerização é a DNA polimerase termo-estável (Taq), tendo sido isolada a partir da bactéria termofílica Thermus aquaticus que vive em elevadas temperaturas. É essencial que a enzima usada seja estável ao calor, uma vez que os ciclos de PCR têm lugar a temperaturas situadas entre os 64°C e 95°C. Para executar este ciclo usa-se um termociclador, que faz variar de forma rigorosa o tempo e a temperatura ao longo do ciclo. Normalmente são repetidos cerca de 30 ciclos, o que demora apenas algumas horas.

Assim, duas novas cadeias são sintetizadas a partir da cadeia molde em cada ciclo completo de PCR logo dá-se um crescimento exponencial, havendo ao fim de n ciclos 2n vezes mais cópias do que no início.

(  F  ) –  O sequenciamento de DNA pelo método de Sanger é baseado na produção de fragmentos de DNA que possuem um didesoxiribonucleotídeo (ddNTP)  A,U,C ou G marcado com um fluoróforo no final da cadeia. A produção dos fragmentos de DNA deve-se ao fato de que a incorporação de ddNTP causa uma interrupção durante a síntese das cadeias de DNA, e a sequência dos fragmentos é analisada por eletroforese capilar.

Na vdd é add ddNTP de A, T, G e G.

(  F  ) –  Para desenhar primers iniciadores de uma amplificação de DNA, é necessário ficar atento a características como, por exemplo, utilizar de 18 a 22 nucleotídeos, utilizar temperatura de anelamento entre 75-80°C e que o anelamento seja realizado em cadeias contendo 2 ou 3 nucleotídeos seguidos.

A temperatura de anelamento tem q está em torno de 55-65°C, devesse evitar repetições dos nucleotídeos.

(  F  ) – Para iniciar a amplificação de um fragmento de DNA, é necessário utilizar apenas um primer senso no sentido 3'-5' e um primer anti-senso no sentindo 5'-3'.

Todos os primers devem ser desenhados no sentido 5'-3'.

(  F  ) – A técnica do RFLP é utilizada para detecção de polimorfismos utilizando uma fita de DNA de dois indivíduos distintos que sejam da mesma espécie, onde há a utilização de uma proteína que se liga a um sítio específico e cliva o DNA, formando fragmentos.

Não é uma proteína que se liga a um sítio e cliva o DNA, isso é o papel da enzima de restrição.

(  F  ) – Para realizar um PCR convencional é necessário ter os seguintes materiais – Taq polimerase,  RNA molde, primers (iniciadores) e nucleotídeos.

Além desses materiais é necessário que tenha água, uma solução tampão, cloreto de magnésio e uma fita molde de DNA para que se realizar a PCR Convencional.

(  F ) – O PCR é realizado através das seguintes etapas- Desnaturação a 85°C, anelamento dos primers a 40-55°C e  extensão a 72°C.

A etapa de desnaturação ocorre a 94-95°C, o anelamento ocorre a 55-65°C (varia por causa da quantidade de C e G encontrado nos primers) e a extensão está correta, ocorre a 72°.

(  F ) – Após cada ciclo de replicação, a quantidade de moléculas de DNA obtida é sempre o quádruplo do ciclo anterior.

É falso pq a quantidade de moléculas de DNA obtidas após cada ciclo é o dobro da anterior sempre.

(  F ) - O PCR com “Hot Start” é mais eficiente porque impede que as fitas de DNA sejam degradadas.

Na vdd a enzima Pol possui um inibidor (anticorpo), que se desnatura e ativa a enzima Pol ao atingir temperatura de 94-95°C e sem esse inibidor as enzimas Pol amplificariam produtos indesejados em temperatura ambiente e seria possível ver apenas um rastro na eletroforese, sendo difícil saber o resultado da PCR.

(   F ) - Durante o RT-PCR, é necessário utilizar a Taq polimerase exata para o experimento alvo, pois isso pode degradar a fita de RNAm.

A fita de RNAm já é degradada pelas as RNAses (ribonucleases) após a síntese de RNA para cDNA.

(  V ) – O sistema de detecção de cópias de DNA durante o qPCR (PCR em tempo real) é baseado na utilização de marcadores fluorescentes que emitem fluorescência após a extensão das fitas novas recém sintetizadas.

(  F ) – A curva de amplificação produzida durante o qPCR (PCR em tempo real) é baseada na fluorescência emitida pelas cópias de DNA no final do último ciclo.

Se fosse só do último ciclo não haveria curva, na vdd é no final de cada ciclo e costuma-se fazer por volta de 40 ciclos mais ou menos, que possibilita ver uma curva no final.

(  F ) – O RT-PCR é uma alteração do PCR convencional que permite observar o número de cópias amplificadas durante cada ciclo de replicação.

A RT-PCR realiza o processo contrário que ocorre em uma célula, ela transforma RNA em DNA e amplifica isso, enquanto a PCR convencional amplifica fragmentos de DNA alvo. A PCR que possibilita observar a amplificação das cópias é o PCR em Tempo Real.