Biologia Molecular: Tradução, Regulação e DNA Recombinante

Tradução Gênica

Elementos necessários para a tradução: RNAm, RNAt, enzimas e aminoácidos. A tradução ocorre em quatro etapas:

• Ativação: Ligação do aminoácido ao RNAt (energia na forma de GTP).
• Iniciação: Montagem dos componentes necessários para a tradução.
• Alongamento: Ligação do aminoácido à cadeia polipeptídica.
• Término: Finalização da tradução com o códon finalizador (códon de parada).

Regulação Gênica

A regulação gênica é controlada em diversos níveis: regulação da estrutura do gene, transcrição, processamento do RNA, estabilidade do RNA, tradução e modificação pós-traducional (Complexo de Golgi – acabamento final da proteína).

Regulação gênica → Proteína reguladora → Sequência específica do DNA.

Regulação em bactérias: Os genes são agrupados em operons (conjunto de genes estruturais e genes reguladores). Tipos de regulação:

• Negativa: A proteína repressora liga-se ao DNA e impede a transcrição.
• Positiva: A proteína ativadora liga-se ao DNA e ativa a transcrição.

Operon Lac (E. coli)

O Operon lac é um operon induzível negativo. Sua regulação ocorre na presença de glicose ou lactose:

1. Na ausência de lactose, um repressor liga-se ao sítio operador e impede a transcrição dos genes estruturais (lacZ, lacY, lacA) que codificam a β-galactosidase, a permease e a transacetilase.
2. Quando a lactose está presente, parte dela é convertida em alolactose, a qual se liga à proteína repressora e a inativa, permitindo que os genes estruturais sejam transcritos e que a lactose seja metabolizada.
3. Quando acaba toda a lactose do meio, o repressor novamente se liga ao operador, bloqueando a transcrição.

Tecnologia do DNA Recombinante

Enzimas de restrição: Reconhecem no DNA sequências palindrômicas e “cortam” a molécula dentro dessas sequências. Sequência palindrômica: Mesma sequência de nucleotídeos tanto na direção 3’ → 5’ como na 5’ → 3’.

Tipos de corte realizados pela enzima de restrição:

• Extremidades abruptas: 5’---AGCT---3’ / 3’---TCGA---5’
• Extremidades coesivas: 5’---CTTAA↓G---3’ / 3’---G↑AATTC---5’

Vetores de Clonagem

• Plasmídeo: É um DNA de dupla fita extracromossômico, importante para conferir resistência a antibióticos para a bactéria. Restrição: O tamanho do gene não pode ser maior do que ± 4 mil pares de bases. Obs: Utilizamos enzimas de restrição para criar extremidades proeminentes, facilitando a ligação entre o vetor e o gene de interesse.
• Bacteriófagos (Fago λ): É um vírus cujo material genético é um DNA de dupla fita e que parasita especificamente bactérias. Vantagem: Aceita até 23 mil pares de bases e o gene de interesse fará parte do DNA cromossômico da bactéria.
• Cosmídio: Vetor de clonagem construído a partir de um plasmídeo bacteriano e de um DNA viral. Possui como vantagem a possibilidade de clonar genes entre 5 mil a 7 mil pares de bases, unindo características de plasmídeos e vírus.
• YAC (Cromossomo Artificial de Levedura): Um dos primeiros vetores para células eucarióticas; seu sítio de clonagem aceita genes com até 40 mil pares de bases.

Vetores de Expressão para Células Eucarióticas

Banco de dados genômico (2 tipos):

• Banco genômico: Todo o DNA genômico do organismo clonado.
• Banco de cDNA: Produzido a partir do RNAm via transcriptase reversa.

Componentes do Vetor:

• Ori do promotor SV-40: Responsável pela replicação do vetor ou sítio de início da transcrição (Transcrição → RNAm → Proteína, ex: insulina).
• Sítio múltiplo de clonagem (Polilinker): Local de inserção do fragmento de DNA de interesse; aceita diferentes tipos de genes.
• Ori procariótico: Função exclusiva de replicação do vetor em células procarióticas (E. coli).
• Gene AmpR (AMP): Necessário para selecionar as bactérias que contenham o vetor com o gene clonado.