Fundamentos da Espectrofotometria: Guia Completo
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Fundamentos da Espectrofotometria
A análise fotométrica é uma das técnicas mais utilizadas para determinar a concentração de soluções de compostos químicos ou biológicos, sendo um método fundamental em laboratórios clínicos. A fotometria é uma técnica de análise quantitativa que mede a intensidade de absorção de luz monocromática por um composto em solução.
Os espectrofotômetros são instrumentos que medem a absorção de energia radiante. Eles utilizam prismas ou grades de difração para selecionar faixas do espectro: ultravioleta (até 380 nm), visível (381-700 nm) ou infravermelho (acima de 700 nm).
Componentes do Espectrofotômetro
- 1. Fonte de luz: Emite comprimentos de onda (lâmpada de tungstênio para visível e de hidrogênio para ultravioleta).
- 2. Colimador: Transmite um feixe retilíneo de luz.
- 3. Monocromador: Prisma ou grade que resolve a radiação em vários comprimentos de onda (λ).
- 4. Fenda: Seleciona o comprimento de onda desejado.
- 5. Porta-cubeta e cubeta: Local onde se coloca a solução.
- 6. Detector: Célula fotoelétrica que transforma energia radiante em elétrica.
- 7. Medidor elétrico (galvanômetro): Registra a leitura de Transmitância (T) ou Absorbância (A).
Princípios Físicos
Quando a energia radiante atravessa uma solução, a energia incidente (Io) é atenuada pela energia emergente (I) devido a reflexões, dispersão por partículas ou absorção pela solução.
- Absorbância (A): Relação logarítmica entre a energia incidente (Io) e a transmitida (I).
- Transmitância (T): Relação entre a energia transmitida (I) e a incidente (Io).
Lei de Lambert-Beer: A = ε . l . c. A absorbância é diretamente proporcional à concentração da solução.
Procedimentos Laboratoriais
Curva de Calibração e Solução Padrão: Essenciais para garantir resultados exatos. A solução padrão serve como referência para determinar concentrações desconhecidas.
Uso do Branco: Utilizado para zerar o sistema, eliminando a absorbância de reagentes, cubetas e perdas por reflexão.
Seleção da Área Espectral: Deve-se utilizar a faixa do espectro onde a absorção é máxima (espectro de absorção).
Exemplo Prático: Dosagem de Proteína no Soro
Procedimento: Diluir a amostra (1:20) e reagir com Biureto. Realizar a leitura em 540 nm após 10 minutos de repouso.
Cálculo:
Amostra [mg/mL] = (Absorbância da amostra / Absorbância do padrão) × Concentração do padrão [mg/mL]
Valores normais: 60 a 80 mg/mL.