Guia Completo: PCR, RT-PCR e Técnicas de Biologia Molecular

Fundamentos de Biologia Molecular e PCR

• Os métodos baseiam-se na replicação de DNA que utiliza uma enzima dependente de iniciadores que funciona na direção 5’-3’.
• O genótipo GG apresenta 2 bandas no gel; o genótipo GA tem 3 bandas e o genótipo AA tem 1 banda.
• PCR é um método mais sensível que microarranjo.
• Primer senso: 5’-CCACGTGCGCCTTATAGCCT-3’ e primer antisenso: 5’-ACTCTTTGCATTTGCAGGAG-3’.
• Tamanho do fragmento: 280 bp.
• Sim, embora degradado, há algum DNA nos bulbos capilares que pode ser utilizado.
• PCR para regiões variáveis curtas: STRs (short tandem repeats).
• Os pesquisadores precisam isolar RNA, fazer um RT-PCR com iniciadores específicos, ligar o produto de PCR a um plasmídeo e transformar o plasmídeo com fragmento de PCR em uma bactéria para expressão da proteína recombinante.
• Colocar o gene da recombinase sob o comando de um promotor oriundo de um gene expresso apenas no tecido alvo.
• O gene pode ser regulado no nível genético e epigenético para contribuir para o fenótipo.
• Um fragmento de DNA responsável pela síntese de um antígeno é inserido em um plasmídeo, a partir das técnicas de DNA recombinante, e transformado em bactérias. A proteína é purificada após ter a expressão induzida nas bactérias e injetada nos camundongos, disparando a resposta imune.
• Altamente conservado para permitir comparação de inúmeras espécies, onde poucas variações seriam suficientes para permitir o agrupamento.
• Métodos de extração e purificação de DNA, amplificação de DNA, construção de bibliotecas de DNA, sequenciamento de segunda geração e bioinformática.
• Localização do DNA: No cromossomo Y e na Mitocôndria.
• Parâmetros de PCR: Temperatura de anelamento.
• Técnicas que não dependem de PCR: RISA e FISH.
• Parâmetros para o melhor par de primer: Temperatura de melting e tamanho do primer.

Como ocorre a transcriptase reversa?

A transcriptase reversa é uma enzima, também denominada DNA-polimerase RNA-dependente, responsável por realizar o processo de transcrição, que corresponde a uma “cópia invertida” em relação ao padrão celular. Essa enzima polimeriza moléculas de DNA a partir de moléculas de RNA.

Certos vírus como o HIV, chamados de retrovírus, injetam seu material genético na célula hospedeira. Utilizando os nucleotídeos presentes no citoplasma, a enzima monta uma fita de DNA a partir da fita de RNA viral. A molécula de RNA original é destruída pela enzima RNAse-H por hidrólise.

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  O elucidamento desse processo permitiu o desenvolvimento da tecnologia da PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), um método de amplificação de DNA a partir de moldes de RNA, denominado RT-PCR.

• O que é um gene? O Encode define gene como uma sequência do genoma onde algum produto funcional é gerado.
• O que é DNA? É um complexo de moléculas que contém todas as informações necessárias para construir e manter um organismo.
• Por que o DNA não tem Uracila? A Timina é uma 5'-metil-uracila. O radical metil auxilia na proteção da molécula. Além disso, a desaminação da Citosina forma Uracila, um mecanismo de reparo importante. O DNA precisa ser conservado, enquanto o RNA é reciclado rapidamente.

Conceito de PCR e Fases

A PCR é uma metodologia baseada na amplificação exponencial seletiva de DNA. Um ciclo de PCR consiste em três fases:

1. Desnaturação: Separação das cadeias de dupla hélice (95°C).
2. Anelamento (Annealing): Ligação dos primers (55-65°C).
3. Polimerização (Extensão): Síntese da nova fita pela Taq polimerase (72°C).

Análise de Afirmações (Verdadeiro ou Falso)

• (F) O sequenciamento de Sanger utiliza ddNTPs (A, T, C, G) marcados com fluoróforos para interromper a síntese.
• (F) Primers devem ter de 18 a 22 nucleotídeos e temperatura de anelamento entre 55-65°C.
• (F) Todos os primers devem ser desenhados no sentido 5’-3’.
• (F) O RFLP utiliza enzimas de restrição para clivar o DNA em sítios específicos.
• (F) Materiais para PCR: Taq polimerase, DNA molde, primers, nucleotídeos, água, tampão e cloreto de magnésio.
• (F) A desnaturação ocorre a 94-95°C.
• (F) A quantidade de DNA dobra a cada ciclo (crescimento exponencial).
• (F) O "Hot Start" utiliza um inibidor (anticorpo) que é inativado a 94-95°C para evitar amplificações inespecíficas.
• (F) A fita de RNAm é degradada por RNAses após a síntese de cDNA.
• (V) O qPCR utiliza marcadores fluorescentes para detecção em tempo real.
• (F) A curva de amplificação do qPCR é baseada na fluorescência medida ao final de cada ciclo.
• (F) O RT-PCR transforma RNA em DNA; o PCR em Tempo Real (qPCR) é que permite observar o número de cópias durante a amplificação.