Interações in vitro antígeno/anticorpo

DE COMPETIÇÃO COM Ag MARCADO
·Inicialmente, uma quantidade conhecida de anticorpos específicos é colocada na fase sólida.
·Em seguida, adiciona-se o antígeno marcado com ¹²⁵ I.
·Uma amostra de soró de um paciente suspeito é então acrescentada.
·O antígeno, se presente no soró, compete com o antígeno radioativo pelos sítios de ligação nos anticorpos.
·A quantificação é feita em aparelho específico pára a leitura de radioatividade. A concentração das moléculas antigênicas presentes na amostra é inversamente proporcional à leitura de radioatividade.
·Inicialmente, antígenos são fixados na fase sólida.
·A seguir, acrescenta-se a amostra do paciente
·Os anticorpos específicos e marcados com o radioisótopo são acrescentados.
·Se a amostra for positiva, haverá a formação do complexo Ag/Ac com o Ag do soró.
·Quanto maior a quantidade de antígeno na amostra, maior será a ligação destes aós anticorpos, formando imunocomplexos, que serão retirados por lavagem e assim reduzindo a leitura da radioatividade.
SANDUÍChé OU CAPTURA DE Ag
Teste realizado em duas etapas:
Primeira etapa:
1) Fixação de Acs não marcados na fase sólida.
2) Adição da amostra (que contém Ag específicos contra o Ac fixado e outros componentes não específicos).
3) Os Ac capturam os Ag específicos da amostra.
4) Deverá ocorrer uma primeira lavagem pára eliminação de componentes não específicos.
Segunda etapa:
1) Acrescenta-se um segundo anticorpo específico e marcado, que formará o sanduíché.
2) A formação do imunocomplexo será revelada por este segundo anticorpo.

Elisa
Ensaio imunoenzimátiço que utiliza antígenos ou anticorpos marcados com enzimas, seguidos da adição de um substrato. Permite a detecção e quantificação de substâncias de interesse biológico.
É um teste com alta sensibilidade, especificidade, é rápidó, de baixo custo, e pode ser adaptado a diferentes graus de automação
Princípió Básico: Imobilização de um dos reagentes (Ag ou Ac) na fase sólida, enquanto o outro reagente (Ag ou Ac) esta ligado a uma enzima.
Fase sólida: Poliacrilamida, agarose, poliestireno, etc. Geralmente são usadas placas de 96 póços, por permitirem a realização de múltiplos ensaios e automação.
Ensaios em fase sólida

Competitivo

Não competitivo-indirecto

ELISA Indireta - Etapas:
1^a Etapa:

Sensibilização da placa
Ligação do Ag ou Ac à placa, através de interações hidrofóbicas.
LAVAGEM
2^a Etapa: Bloqueio
O bloqueio é feito com uma solução com alta concentração de proteína inerte (leite desnatado, albumina bovina -BSA). Serve pára evitar ligações inespecíficas.
LAVAGEM
3^a Etapa: Adição da amostra
Soró
LAVAGEM
4^a Etapa: Adição do Conjugado
Anticorpo marcado com enzima
LAVAGEM
5^a Etapa: Adição do Substrato
Cromógeno - Formação de uma cor
6ª Etapa: Adição da solução STOP