Meios de Cultura e Biossegurança em Microbiologia

Preparação, Acondicionamento e Controle dos Meios de Cultura

Exigências Nutritivas

• Fonte de Carbono
• Fonte de Nitrogênio
• Fonte de Energia
• Fonte de Sais Minerais
• Vitaminas e Aminoácidos

Exigências Inerentes

• pH: apropriado e não ácido
• Temperatura: antes = frio
• Pressão Osmótica
• Grau de Umidade
• Tensão de Oxigênio: aeróbias, anaeróbias, facultativas e microaerófilas

Preparo do Meio

• Sólido: em placa
• Tubo: (1) horizontal e (2) inclinado

Classificação dos Meios de Cultura

Quanto à Consistência

• Líquido: Nutrientes em solução aquosa e inexistência de ágar;
• Semissólido: Presença de nutrientes e ágar em concentração [ ] menor que 15g/1000ml;
• Sólido: Presença de nutrientes e ágar em concentração [ ] maior que 15g/1000ml.

Quanto à Função

• Enriquecedor: Permite o crescimento de microrganismos que necessitam de fatores de crescimento, mas não inibem o crescimento de outros;
• Seletivos: É aquele que inibe o crescimento de microrganismos, porém permite o crescimento de outros;
• Diferenciador: Possui substâncias que evidenciam uma característica que permite separar um grupo ou uma espécie de microrganismos;
• Manutenção: Permite a viabilidade e manutenção de características fisiológicas de um microrganismo.

Quanto à Natureza

• Animados: É constituído de células vivas (animais de laboratório, tecidos vivos ou ovos embrionados);
• Inanimados: Não é formado por células vivas.
  • Naturais: Contêm substâncias provenientes da natureza;
  • Sintéticos: Formados por substâncias químicas preparadas em laboratório;
  • Semissintéticos: União de compostos naturais e sintéticos.

Exemplos de Meios de Cultura

Quanto à Consistência

• Líquido: THIO (Thioglycollate medium), BHI (Brain Heart Infusion);
• Semissólido: SIM (Sulfeto Indol Motilidade);
• Sólido: MSA (Manitol Salt Ágar), AS (Ágar Sangue).

Quanto à Função

• Enriquecedor: BHI, AS;
• Seletivos: MSA, MC (MacConkey);
• Diferenciador: MC, AS;
• Manutenção: NA (Nutriente Ágar).

Quanto à Natureza

• Animados: Cultura Celular;
• Inanimados: Natural (Leite), Sintéticos (MSA), Semissintéticos (AS).

Composição dos Meios

BHI (Meio enriquecido e líquido): Infusão de cérebro e coração, Peptona, Dextrose, Cloreto e Fosfato de Sódio, Água destilada.

MC (MacConkey – meio seletivo e sólido em placa): Sais biliares, Peptona, Lactose, Cloreto de Sódio, Ágar, Vermelho Neutro, Cristal Violeta, Água destilada.

Controle e Armazenamento

• Autoclavagem: 121 °C por 30 min;
• Refrigeração: contínua.

Armazenamento dos Meios

• Inicialmente devem ser guardados na geladeira dentro de plásticos para evitar a desidratação;
• Os tubos devem ser isolados com rolhas e alumínio na geladeira;
• Após a inoculação, deve ser incubado em estufa à temperatura ambiente;
• Identificação do conteúdo, data de preparação e vencimento.

Controle de Qualidade

Uma amostra do lote deve ser inoculada e observada para testar a viabilidade dos nutrientes e a certeza de resultados. Ex: Estreptococos grupo A em ágar sangue – observar bom crescimento e beta-hemólise.

Crescimento Bacteriano

O crescimento bacteriano depende de: Exigências Nutritivas e Exigências Inerentes.

Medidas Assépticas para a Inoculação do Meio de Cultura

• Alças flambadas antes e depois;
• Deve-se esperar o resfriamento;
• Os recipientes contendo meios deverão ser abertos somente na zona de esterilidade gerada pelo Bico de Bunsen;
• A boca do tubo de ensaio deve ser aquecida antes e depois de ser retirada a tampa;
• A rolha nunca deve ser apoiada na bancada.

Inoculação Pour-plate

O objetivo é obter colônias isoladas (estudo qualitativo) para realizar a contagem de colônias (estudo quantitativo).

Plaqueamento - Pour-plate

Acondicionamento X Crescimento:

• Identificação no fundo da placa e tubo;
• Temperatura e tensão de oxigênio ideais;
• Período: entre 18 e 24 horas;
• Observa-se macroscopicamente a multiplicação bacteriana (Fase LOG).

Resultados e Interpretação

• Quantidade de Crescimento: escassa, moderada ou abundante;
• Margem: uniforme ou irregular;
• Forma: circular, irregular ou rizoides;
• Distribuição de crescimento no meio de cultura:
  • Uniformemente distribuído;
  • Confinado à superfície do meio como um filme ou película;
  • Acumulado como sedimento que pode ser granuloso ou viscoso.
• Cromogênese: opaca, translúcida ou com pigmento;
• Odor: pútrido, aromático ou desprezível.

Investigação da Atmosfera de Crescimento

O Laboratório de Microbiologia

Vidraria

Normas Adotadas

• Desinfetar a bancada e equipamentos;
• Não comer ou fumar;
• Usar jaleco dentro do laboratório;
• Lavar as mãos;
• Notificar acidentes;
• Seguir o protocolo de manuseio dos equipamentos;
• Trabalhar dentro da área de segurança do bico de Bunsen;
• Flambar alças, agulhas e pinças;
• Observar manobras assépticas.

Processos de Controle do Crescimento Bacteriano

• Esterilização: Inativação total por processos físicos e químicos quanto ao potencial reprodutivo;
• Microbiostático ou Bacteriostático;
• Microbicida ou Bactericida;
• Desinfecção: Elimina microrganismos quanto à sua potencialidade infecciosa no objeto, superfície ou local tratado;
• Antissepsia: Semelhança à desinfecção no organismo humano.

Agentes Físicos e Químicos

Infecções Adquiridas em Laboratório

• Vias normais de infecção: pele, mucosas, vetores, inalação, ingestão.
• Outras Vias - Inoculação acidental: agulhas e seringas, objetos cortantes como vidro quebrado, mordida ou arranhão de animal de laboratório.
• Ingestão acidental: Respingos nos olhos, face e dedos.
• Aerossóis: São micropartículas sólidas ou líquidas, com dimensões aproximadas entre 0,1 micrômetro e 50 micra, que podem permanecer em suspensão em condições viáveis por várias horas e alcançam alvéolos pulmonares.

Detecção de Contaminação Profissional

Em casos de o profissional do laboratório apresentar certa doença, como detectar que a contaminação foi feita com um microrganismo isolado no laboratório? Resposta: Utilizar biologia molecular. Fazer o sequenciamento do material genético do microrganismo que contaminou o profissional e da amostra isolada, comparando as regiões homólogas. A presença destas regiões homólogas determina a positividade do teste.

Classificação dos Microrganismos por Classe de Risco

Para classificar um microrganismo dentro dessas classes, é preciso caracterizá-lo da seguinte forma:

• Ele é patogênico para o ser humano?
• Há risco de contaminação para os técnicos de laboratório?
• É transmissível à comunidade?
• Há tratamento ou medidas profiláticas?

Classes de Risco

• Grupo I: Microrganismos que possuem poucas chances de causar doença ao ser humano. Ex: Bacillus cereus.
• Grupo II: Microrganismos que representam risco moderado e coletivo limitado. Possuem potencial para causar doença no homem, mas com poucas chances de transmissão para os profissionais do laboratório. Ex: Schistosoma mansoni.
• Grupo III: Microrganismos que representam alto risco de causar doença no homem, com elevadas chances de transmissão para os profissionais do laboratório. Ex: Mycobacterium tuberculosis, HIV.
• Grupo IV: Microrganismos que representam risco altíssimo de causar doença no homem, sendo estas doenças muito graves e sem tratamento ou medidas profiláticas. Elevado risco de espalhar-se pelo laboratório e para os profissionais. Ex: Vírus Ebola.

Cabines de Segurança Biológica e Fluxo Laminar

São equipamentos apropriados que oferecem proteção para se trabalhar com patógenos. As cabines são sempre verticais e os fluxos são horizontais. São classificadas em Grau I, II, III e mista.

Classificação das Cabines Biológicas

• Classe I: O ar penetra pela frente da cabine, os aerossóis não escapam em direção ao operador, fornecendo proteção somente a este. Trabalha-se com microrganismos do grupo de risco I.
• Classe II: O ar penetra pela grade do chão da cabine e sobe, fornecendo um elevado grau de proteção ao operador e ao material manipulado. Podem ser trabalhados microrganismos dos grupos de risco I, II e III.
• Classe III: O operador é separado da área de trabalho por uma barreira física e só entra em contato com o material através de luvas. Trabalha-se com microrganismos do tipo IV.
• Classe híbrida I/III: É a cabine de classe I cuja barreira física só é atarraxada quando necessário. Funciona como I e III.

As cabines de segurança possuem filtros formados por microfibras com alumínio intercalado. Esse filtro chama-se HEPA (High Efficiency Particulate Air) e possui uma eficiência de filtração de 99,7%.

Nota sobre vírus: Os filtros são eficientes para microrganismos até 300 nm (tamanho de bactérias). Os vírus, por leis físicas, quando estão sob forma de aerossóis, não estão individualizados; eles estão agrupados em partículas maiores que 300 nm, tornando a filtração eficiente.

Classificação das Unidades de Trabalho (Níveis de Contenção)

A classificação dos laboratórios em níveis de contenção depende do grupo de risco do microrganismo e das manipulações e procedimentos utilizados.

Nível de Contenção I

• Trabalha-se com microrganismos do grupo de risco I.
• Exige-se uma pia e um lava-olhos.

Nível de Contenção II

• Trabalha-se com microrganismos do grupo de risco I e II.
• Localiza-se longe de escritórios e áreas de acesso público.
• Possui sinalização na porta; as portas permanecem trancadas durante o trabalho.
• Exige-se uma pia e um lava-olhos.
• A autoclave está dentro do laboratório.
• É obrigatória a presença de cabine de segurança.

Nível de Contenção III

• Trabalha-se com microrganismos do grupo de risco I, II e III.
• Localiza-se longe de escritórios e áreas de acesso público.
• Possui sinalização na porta; as portas permanecem trancadas durante o trabalho.
• Exige-se uma pia e um lava-olhos.
• A autoclave está dentro do laboratório.
• É obrigatória a presença de cabine de segurança.
• O acesso de visitantes é controlado.
• Trabalha-se sob pressão negativa.
• O ar eliminado para o exterior tem de passar pelo filtro HEPA.
• O pessoal é altamente treinado e submetido a acompanhamento médico com controle sorológico.

Nível de Contenção IV

• Trabalha-se com microrganismos do grupo de risco IV.
• Geograficamente isolado; possui uma unidade independente.
• É obrigatória a presença de cabine de segurança classe III.
• Trabalha-se sob pressão positiva e com roupas apropriadas.
• O pessoal é altamente treinado e submetido a acompanhamento médico constante.
• Segue todas as recomendações dos níveis anteriores.