Hibridização, Biochips e Clonagem de DNA

Hibridização com sondas de DNA: pesquisa específica de um gene

A hibridização de DNA é um fenômeno natural e uma das técnicas fundamentais da tecnologia do DNA recombinante. A hibridização do DNA é o processo em que duas fitas de DNA de fita simples, com uma sequência de bases complementares, se reúnem para formar uma molécula de cadeia de DNA de fita dupla corretamente emparelhada.

Mas por que a hibridização de DNA é uma técnica fundamental para a biotecnologia? Pois permite identificar a presença de um gene que codifica uma proteína de interesse em um cromossomo. Para isso, é realizado um teste de hibridização com sondas de DNA.

Uma sonda de DNA é um fragmento de DNA artificial de fita simples (single-stranded) marcado com um isótopo radioativo ou fluorescência, cuja sequência é complementar à sequência de nucleotídeos do gene a ser detectado. A detecção de uma sonda de DNA hibridizada é alcançada através de diversos métodos, como, por exemplo, a impressão em um filme radiográfico.

Biochips e Microarrays

Quando se deseja analisar milhares de genes simultaneamente, utilizam-se microarrays ou chips de DNA, cuja tecnologia tem revolucionado a genética da mesma forma que os chips de silício revolucionaram a indústria de computadores. Os biochips são lâminas de vidro onde são fixados, em cada uma de suas células microscópicas, um pequeno número de fragmentos de sequência de DNA de fita simples que atuam como sondas para um determinado gene.

Os milhares de células microscópicas são colocadas em uma grade sobre a lâmina de vidro (cujo tamanho não excede o de um selo postal) e permitem o desenvolvimento de milhares de reações de hibridização paralelas. Conhecendo a localização exata de cada sonda sobre o biochip, qualquer fragmento de DNA que hibridize com um deles pode ser identificado como um gene particular, simplesmente localizando a posição da sonda anexada ao biochip.

A tecnologia de biochips é utilizada para:

• Detectar mutações em genes que causam doenças como a hemofilia, a fibrose cística, a doença de Huntington e a distrofia muscular de Duchenne;
• Controlar a expressão de genes em linhagens de células cancerígenas humanas;
• Diagnóstico de doenças infecciosas;
• Tratamento medicamentoso personalizado, considerando que diferenças genéticas produzem diferentes reações individuais ao tratamento;
• Sugerir novas técnicas diagnósticas ou terapêuticas.

Clonagem de DNA

A palavra clonagem significa a produção de cópias geneticamente idênticas através de reprodução assexuada. A população resultante é chamada de clone. Mas o que significa esta palavra quando aplicada ao DNA? A clonagem de um fragmento de DNA é a obtenção de bilhões de cópias idênticas a esse fragmento.

Para clonar um fragmento de DNA, este deve ser adicionado a uma molécula transportadora, também chamada de vetor. Um vetor de clonagem é uma pequena molécula de DNA capaz de entrar em uma bactéria e se autorreplicar nela. Hoje, há muitos vetores de clonagem, embora os mais utilizados sejam os plasmídeos bacterianos.

O método de clonagem é o seguinte: o plasmídeo e o DNA a ser clonado são cortados com a mesma enzima de restrição. Com o corte, obtêm-se plasmídeos recombinantes que são incubados com uma cultura bacteriana (geralmente Escherichia coli). Em condições adequadas, cada bactéria incorpora apenas um plasmídeo recombinante, processo chamado de transformação.

Como os plasmídeos carregam um gene que confere resistência a um antibiótico, as bactérias transformadas podem ser selecionadas colocando-as em placas de cultura com o antibiótico. Apenas as bactérias que carregam o plasmídeo recombinante serão resistentes, capazes de sobreviver e formar colônias. Outras, que não foram transformadas, morrerão. Cada colônia de bactérias isolada é mantida em condições de crescimento; conforme a bactéria se duplica, também se duplica o número de plasmídeos recombinantes e os fragmentos de DNA inseridos. O conjunto de clones obtidos é chamado de biblioteca genômica ou biblioteca de DNA.

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

A partir de pequenas quantidades, o DNA pode ser copiado ou amplificado muitas vezes dentro de um tubo de ensaio, sem clonagem. A técnica é baseada em um processo chamado Reação em Cadeia da Polimerase (PCR - Polymerase Chain Reaction).

A PCR é uma reação em cadeia que origina milhões de cópias de um segmento específico do DNA, repetindo vários ciclos de replicação in vitro. O material de partida é a amostra de DNA a ser copiada, os quatro nucleotídeos, duas moléculas de DNA de fita simples (primers ou iniciadores) complementares às sequências do gene e uma DNA polimerase resistente ao calor, como a Taq polimerase (da bactéria Thermus aquaticus, descoberta perto dos gêiseres de Yellowstone).

A PCR é uma ferramenta usada rotineiramente para amplificar segmentos de DNA de uma ampla variedade de fontes, como pequenas quantidades de sangue, tecidos ou sêmen coletados em cenas de crime, microrganismos patogênicos ou identificação de células embrionárias para o diagnóstico pré-natal de doenças genéticas.